KMT2D在制备抗肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了KMT2D在制备抗肿瘤药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术通过生物信息学手段分析KMT2D的蛋白结构，最终筛选得到KMT2D蛋白的两个本质无序的结构LCD1和LCD2，结合基因编辑技术研究了这两个结构对KMT2D的功能影响；并进一步重点研究了KMT2D酶促复合物的变化（包括mRNA和蛋白水平），为深入理解KMT2D促进肿瘤的机制奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
KMT2D在制备抗肿瘤药物中的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及KMT2D在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
组蛋白-赖氨酸-N-甲基转移酶2D（Histone-lysineN-methyltransferase2D，KMT2D）是组蛋白H3K4的一种甲基转移酶，在大多数哺乳动物中，组蛋白的甲基化主要存在于转录基因的增强子和启动子区域，与基因转录活性密切相关。增强子甲基化导致其他共激活因子募集，促进靶基因RNA聚合酶II的激活，最终控制基因转录，可与赖氨酸去甲基化酶（Lysinedemethylases，KDM）相互作用选择性的调控基因的转录。KMT2D基因含有54个外显子和53个内含子，属于赖氨酸甲基转移酶2（Lysinemethyltransferase2，KMT2）的家族成员，在整个真核生物进化中高度保守。KMT2D蛋白结构上主要包含N-末端的两个植物同源异型结构域（PHD）簇和酶活性C末端SET结构域，第二簇中的PHD（PHD4-6）主要负责KMT2D蛋白靶向未甲基化的核小体上的H4组分。酶活性C末端SET结构域，主要负责KMT2D甲基转移酶的酶促活性并能够维持KMT2D蛋白的稳定性。研究发现，SET结构域附近还有一个PHD结构域和富含苯丙氨酸和络氨酸的N/C末端（FY-richN/C-terminal，FYRN/FYRC）结构域。此外，该蛋白还含有一个高迁移率组（Highmobilitygroup，HMG-I）和9个核受体相互作用基序（Ninenuclearreceptorinteractingmotifs，LXXLL）。一般地，KMT2D蛋白发挥组蛋白一甲基化活性需要依赖于特殊的酶促复合物，即COMPASS复合物（complexproteinsassociatedwithSet1，Set1相关蛋白复合体），主要包括WRAD（WDR5、RBBP5、ASH2L、DPY30）、PTIP、PA1、NCOA6和UTX蛋白复合物。通过数据库分析，KMT2D基因在某些肿瘤中能够促进肿瘤的发展，这在很多研究中得到了证实。研究发现，KMT2D的蛋白结构中存在多处无序蛋白序列，易产生蛋白液-液相分离。然而，KMT2D蛋白液-液相分离功能对肿瘤的功能不清楚。对于KMT2D蛋白，通过生物信息学分析含有两个无序程度很高的区域，即KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2，而这两个区域的功能到目前为止还没有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了KMT2D在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术首次分析了KMT2D蛋白的两个本质无序的结构LCD1和LCD2，并通过基因编辑技术研究了这两个结构对KMT2D的功能影响；并进一步重点研究了KMT2D酶促复合物的变化（包括mRNA和蛋白水平），为深入理解KMT2D促进肿瘤的机制奠定基础，能够深入理解KMT2D蛋白液液相分离与肿瘤的关系，并以此开发新型抗肿瘤策略。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1.通过生物信息学手段分析KMT2D的蛋白结构，最终筛选得到两段LCD结构域。通过体外试验论证了LCD结构域对肿瘤细胞的功能，在PANC1细胞中KMT2D-LCD结构域能够有效地调控细胞的增殖、凋亡、迁移和上皮间质转化（EMT），最终控制了肿瘤的发生发展。2.利用基因编辑技术在HEK293T细胞和PANC1细胞中分别构建KMT2D-LCD1敲除和KMT2D-LCD2敲除的稳转细胞系。在这些稳转细胞系中，进一步探究KMT2D-LCD结构域对肿瘤的调控机制。研究表明，KMT2D-LCD结构域能够有效的调控WDR5蛋白稳定性，同时又能显著影响KMT2D酶促复合物各组分之间的相互作用，主要包括WDR5、ASH2L和RBBP5，进一步探究了KMT2D蛋白的结构，为全面了解KMT2D蛋白的结构功能奠定基础。3.通过实验论证得到两个对肿瘤功能产生重要影响的KMT2D-LCD结构域，由于LCD结构域能够产生较强的液液相分离的微环境，这个微环境对KMT2D酶促复合物的功能至关重要。因此，利用液液相分离微环境的抑制剂将成为抗肿瘤策略的一个新的领域。附图说明图1为KMT2D蛋白的结构示意图。图2为KMT2D-LCD1与KMT2D-LCD2结构域分析。图3为KMT2D与胰腺癌之间的关系。图4为KMT2D-LCD1的敲除策略示意图。图5为KMT2D-LCD2的敲除策略示意图。图6为HEK293T细胞中KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2敲除genotyping鉴定。图7为PANC1细胞中KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2敲除genotyping鉴定。图8为HEK293T细胞中KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2敲除RT-PCR鉴定。图9为PANC1细胞中KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2敲除RT-PCR鉴定。图10为HEK293T细胞中KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2敲除免疫荧光鉴定。图11为PANC1细胞中KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2敲除免疫荧光鉴定。图12为HEK293T细胞中KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2结构对细胞增殖的影响。图13为PANC1细胞中KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2结构对细胞增殖的影响。图14为PANC1细胞中KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2结构对细胞凋亡的影响。图15为KMT2D-LCD1和-LCD2结构对细胞凋亡和EMT途径的RTPCR检测。图16为KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2结构对细胞凋亡和EMT途径的蛋白检测。图17为KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2结构对PANC1细胞迁移的影响。图18为免疫荧光检测KMT2D-LCD1和KMT2D-LCD2结构对PANC1细胞EMT的影响。图19为HEK293T细胞中免疫荧光检测H3K4me1的表达水平。图20为PANC1细胞中免疫荧光检测H3K4me1的表达水平。图21为HEK293T细胞中转录因子KLF4和LIFR的蛋白水平。图22为PANC1细胞中转录因子KLF4和LIFR的蛋白水平。图23为细胞中转录因子KLF4的mRNA水平检测。图24为细胞中转录因子LIFR的mRNA水平检测。图25为HEK293T细胞KMT2D酶促复合物成分ASH2L、RBBP5和WDR5表达水平的检测。图26为PANC1细胞KMT2D酶促复合物成分ASH2L、RBBP5和WDR5表达水平的检测。图27为HEK293T细胞WDR5转录水平的检测。图28为PANC1细胞WDR5转录水平的检测。图29为PANC1细胞中KMT2D-LCD1对WDR5蛋白稳定性的影响。图30为PANC1细胞中KMT2D酶促复合物成分之间的相互作用。具体实施方式以下实施例用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组sgRNA，其特征在于：所述sgRNA的核苷酸序列如下：/nsgRNA A1：ccggggacaatagggcagaatca/nsgRNA A2：ccgggagtgggcaaaacaggcat/nsgRNA B1：ccggtgaggggctatctagctgc/nsgRNA B2：ccgcaggactgtacctctgacag/nsgRNA C1：ccggggtgtagcagtcctctagt/nsgRNAC2：ccggtggcctctcttgagggtgg/nsgRNA D1：ccggtaagtggtcaggtgggagt/nsgRNA D2：ccggaacttgtgtcttatgccac；/n所述sgRNA A1或sgRNA A2用于敲除KMT2D-LCD1结构域上游，sgRNA B1或sgRNA B2用于敲除KMT2D-LCD1结构域下游；/n所述sgRNA C1或sgRNA C2用于敲除KMT2D-LCD2结构域上游，sgRNA D1或sgRNA D2用于敲除KMT2D-LCD2结构域下游。/n

【技术特征摘要】
1.一组sgRNA，其特征在于：所述sgRNA的核苷酸序列如下：
sgRNAA1：ccggggacaatagggcagaatca
sgRNAA2：ccgggagtgggcaaaacaggcat
sgRNAB1：ccggtgaggggctatctagctgc
sgRNAB2：ccgcaggactgtacctctgacag
sgRNAC1：ccggggtgtagcagtcctctagt
sgRNAC2：ccggtggcctctcttgagggtgg
sgRNAD1：ccggtaagtggtcaggtgggagt
sgRNAD2：ccggaacttgtgtcttatgccac；
所述sgRNAA1或sgRNAA2用于敲除KMT2D-LCD1结构域上游，sgRNAB1或sgRNAB2用于敲除KMT2D-LCD1结构域下游；
所述sgRNAC1或sgRNAC2用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张二浩，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32