一种快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法技术

本发明专利技术属于抗药性检测技术领域，公开了一种快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法，所述快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法包括进行草地贪夜蛾的饲养；对草地贪夜蛾进行双酰胺类杀虫剂溶液的滴加；检查草地贪夜蛾死亡状态和死亡数量；采用Polo Plus 2.0软件进行分析，进行草地贪夜蛾基因的相对表达量测定，得到相对表达量在抗性种群中表达量最高的基因。本发明专利技术通过对草地贪夜蛾的室内持续饲养实现对其敏感性与活性的维持，鉴定结果更准确；对草地贪夜蛾施加双酰胺类杀虫剂溶液时直接滴加在虫体上，分布更均匀，提高了抗性监测结果的准确性。通过PCR检测判断草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗性水平，灵敏度高、稳定性好、检测周期短。

A rapid method for identifying the resistance of Spodoptera pratensis to diamide insecticides

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法
本专利技术属于抗药性检测
，尤其涉及一种快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法。
技术介绍
目前：草地贪夜蛾(学名：Spodopterafrugiperda)，是夜蛾科灰翅夜蛾属的一种蛾。成虫在夜间活动，在植物叶子顶部产约100粒卵，卵阶段是在25℃的温度下持续3天。草地贪夜蛾在农业上属于害虫，其幼虫可大量啃食禾本科如水稻、甘蔗和玉米之类细粒禾榖及菊科、十字花科等多种农作物，造成严重的经济损失，其发育的速度会随着气温的提升而变快，一年可繁衍数代，一只雌蛾即可产下超过1000颗卵。2018年以来，草地贪夜蛾在亚洲逐年向北、向南扩展，发生程度越来越重，已扩散至亚洲16个国家。双酰胺类杀虫剂是农业生产中控制草地贪夜蛾等害虫田间为害的主要武器。作为双酰胺类杀虫剂的代表，双酰胺类杀虫剂以其作用机理独特，对靶标害虫高效，对哺乳动物低毒、安全，无交互抗性和对环境友好等其他农药不可比拟的优点，成为杀虫剂发展史上的又一个新突破，具有划时代意义。但是，双酰胺类杀虫剂在田间大面积推广应用后国内外相继报道了草地贪夜蛾抗药性种群的产生和发展。草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂高抗药性的产生和发展，使得该药剂对草地贪夜蛾田间种群的防控效果大大降低，玉米生产基地草地贪夜蛾暴发成灾，给玉米的安全生产和发展造成了严重影响。目前对草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的检测的方法精度较差，准确性无法得到保证。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前对草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的检测的方法精度较差，准确性无法得到保证。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法。本专利技术是这样实现的，一种快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法，所述快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法包括以下步骤：步骤一，在田间进行草地贪夜蛾的捕捉，选择活力好、状态佳，质量为6-8mg的四龄幼虫，将其置于室内饲养箱；步骤二，对选择的草地贪夜蛾进行饲养，饲养中喂食草地贪夜蛾复配饲料；所述草地贪夜蛾饲养方法包括：(2.1)将草地贪夜蛾放置于饲养箱中，添加草地贪夜蛾复配饲料饲养草地贪夜蛾至幼虫老熟；(2.2)将老熟的幼虫放置于添加有潮湿沙壤土的容器中，进行化蛹，同时向容器中添加草地贪夜蛾复配饲料；(2.3)将草地贪夜蛾蛹从容器中取出，进行除湿，直至草地贪夜蛾蛹羽化，即可得草地贪夜蛾成虫；步骤三，将双酰胺类杀虫剂用丙酮水溶液进行溶解，配置五个不同浓度的双酰胺类杀虫剂溶液；步骤四，将步骤二培养的草地贪夜蛾置于培养皿中，分别对不同培养皿中的草地贪夜蛾进行步骤三配制的不同浓度双酰胺类杀虫剂溶液的滴加，一个培养皿中不进行双酰胺类杀虫剂溶液的滴加；步骤五，将处理后的草地贪夜蛾连同培养皿置于温度为26-29℃，相对湿度为70-80％的环境中进行饲养；步骤六，分别在饲养48h和96h时进行草地贪夜蛾状态检查，使用棉棒轻触虫体，确定草地贪夜蛾死亡状态和死亡数量；步骤七，采用PoloPlus2.0软件进行分析，得到草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性；所述采用PoloPlus2.0软件进行分析，得到草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性包括：(7.1)获取草地贪夜蛾死亡数量以及致死的双酰胺类杀虫剂浓度数据，并将死亡数量转化为机率值；(7.2)基于死亡机率值与致死的双酰胺类杀虫剂浓度数据的对数进行毒力回归曲线的绘制；(7.3)将毒力回归曲线与标准曲线对比，即可得到的草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性；步骤八，进行草地贪夜蛾基因的相对表达量测定，得到相对表达量在抗性种群中表达量最高的基因；所述进行草地贪夜蛾基因的相对表达量测定包括以下步骤：(8.1)进行草地贪夜蛾总DNA的提取以及cDNA的合成；(8.2)设计荧光定量PCR引物；(8.3)通过荧光定量PCR检测草地贪夜蛾不同基因的基因表达量；(8.4)进行相对表达量的计算。进一步，步骤二中，所述草地贪夜蛾复配饲料按照质量份数由玉米粉6-8份、麦麸1-2份、可食用琼脂2-3份、蜂蜜1-2份、葡萄糖2-4份、纯净水6-8份组成。进一步，所述草地贪夜蛾复配饲料的制备方法为：(1)将麦麸进行充分研磨，过筛，得到麦麸粉末；(2)将纯净水进行加热至沸腾，加入可食用琼脂，搅拌，得到琼脂液；(3)在琼脂液中加入麦麸粉末、玉米粉、葡萄糖，进行搅拌，得到混合物；(4)在混合物中添加蜂蜜，搅拌均匀，冷却，得到草地贪夜蛾复配饲料。进一步，步骤(2.1)中，所述饲养箱内温度为26-29℃，相对湿度为70-80％，光照为25-32摄氏度；光照时间为17h/d；光照强度为26％。进一步，所述双酰胺类杀虫剂包括邻苯二酰胺、邻甲酰氨基苯甲酰胺和间苯甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂。进一步，步骤三中，所述丙酮水溶液中丙酮与水的体积比为1:1.2。进一步，步骤四中，所述将步骤二培养的草地贪夜蛾置于培养皿中具体为：每个培养皿中盛放两只草地贪夜蛾，共使用六个培养皿。进一步，步骤四中，所述分别对不同培养皿中的草地贪夜蛾进行步骤三配制的不同浓度双酰胺类杀虫剂溶液的滴加，具体为：使用吸管吸取不同浓度的双酰胺类杀虫剂溶液，滴至草地贪夜蛾背部背板上；双酰胺类杀虫剂溶液的滴加量为0.065μL。进一步，步骤(8.1)中，所述进行草地贪夜蛾总DNA的提取以及cDNA的合成，具体为：1)利用TRlzol实际提取草地贪夜蛾的总DNA；2)在PCR反应管中加入2μL基因组缓冲液、1μL去基因组酶gDNAEraser、1μL模板DNA，使用无核酶水定容至10μL；3)将反应体系置于42℃环境下反应2min，然后置于冰上；4)在反应后的PCR管中加入4μL反应缓冲液、4μL反转录酶、1μL引物混合物、4μL无核酶水；5)将反应体系置于37℃环境下反应12min，合成cDNA。进一步，步骤(8.3)中，所述通过荧光定量PCR检测草地贪夜蛾不同基因的基因表达量具体为：步骤Ⅰ，设计PCR反应体系，总体积20μL；步骤Ⅱ，设计PCR反应程序，40℃反应2min，80℃反应2min；然后85℃反应15s，60℃反应34s，40个循环；步骤Ⅲ，添加溶解曲线，85℃进行15s反应，90℃进行2min反应，95℃进行30s反应，50℃进行25s反应。进一步，步骤Ⅰ中，所述设计PCR反应体系，具体为：正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、cDNA模板1.0μL、PlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-UDG10μL、ddH2O8.0μL。结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：本专利技术通过室内对草地贪夜蛾的持续饲养实现对其敏感性与活性的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法，其特征在于，所述快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法包括以下步骤：/n步骤一，在田间进行草地贪夜蛾的捕捉，选择活力好、状态佳，质量为6-8mg的四龄幼虫，将其置于室内饲养箱；/n步骤二，对选择的草地贪夜蛾进行饲养，饲养中喂食按照质量份数由玉米粉6-8份、麦麸1-2份、可食用琼脂2-3份、蜂蜜1-2份、葡萄糖2-4份、纯净水6-8份组成的草地贪夜蛾复配饲料；/n所述草地贪夜蛾饲养方法包括：/n(2.1)将草地贪夜蛾放置于饲养箱中，添加草地贪夜蛾复配饲料饲养草地贪夜蛾至幼虫老熟；/n(2.2)将老熟的幼虫放置于添加有潮湿沙壤土的容器中，进行化蛹，同时向容器中添加草地贪夜蛾复配饲料；/n(2.3)将草地贪夜蛾蛹从容器中取出，进行除湿，直至草地贪夜蛾蛹羽化，即可得草地贪夜蛾成虫；/n步骤三，将双酰胺类杀虫剂用丙酮水溶液进行溶解，配置五个不同浓度的双酰胺类杀虫剂溶液；/n步骤四，将步骤二培养的草地贪夜蛾置于培养皿中，分别对不同培养皿中的草地贪夜蛾进行步骤三配制的不同浓度双酰胺类杀虫剂溶液的滴加，一个培养皿中不进行双酰胺类杀虫剂溶液的滴加；/n步骤五，将处理后的草地贪夜蛾连同培养皿置于温度为26-29℃，相对湿度为70-80％的环境中进行饲养；/n步骤六，分别在饲养48h和96h时进行草地贪夜蛾状态检查，使用棉棒轻触虫体，确定草地贪夜蛾死亡状态和死亡数量；/n步骤七，采用Polo Plus 2.0软件进行分析，得到草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性；/n所述采用Polo Plus 2.0软件进行分析，得到草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性包括：/n(7.1)获取草地贪夜蛾死亡数量以及致死的双酰胺类杀虫剂浓度数据，并将死亡数量转化为机率值；/n(7.2)基于死亡机率值与致死的双酰胺类杀虫剂浓度数据的对数进行毒力回归曲线的绘制；/n(7.3)将毒力回归曲线与标准曲线对比，即可得到的草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性；/n步骤八，进行草地贪夜蛾基因的相对表达量测定，得到相对表达量在抗性种群中表达量最高的基因；/n所述进行草地贪夜蛾基因的相对表达量测定包括以下步骤：/n(8.1)进行草地贪夜蛾总DNA的提取以及cDNA的合成；/n(8.2)设计荧光定量PCR引物；/n(8.3)通过荧光定量PCR检测草地贪夜蛾不同基因的基因表达量；/n(8.4)进行相对表达量的计算。/n...

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法，其特征在于，所述快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法包括以下步骤：
步骤一，在田间进行草地贪夜蛾的捕捉，选择活力好、状态佳，质量为6-8mg的四龄幼虫，将其置于室内饲养箱；
步骤二，对选择的草地贪夜蛾进行饲养，饲养中喂食按照质量份数由玉米粉6-8份、麦麸1-2份、可食用琼脂2-3份、蜂蜜1-2份、葡萄糖2-4份、纯净水6-8份组成的草地贪夜蛾复配饲料；
所述草地贪夜蛾饲养方法包括：
(2.1)将草地贪夜蛾放置于饲养箱中，添加草地贪夜蛾复配饲料饲养草地贪夜蛾至幼虫老熟；
(2.2)将老熟的幼虫放置于添加有潮湿沙壤土的容器中，进行化蛹，同时向容器中添加草地贪夜蛾复配饲料；
(2.3)将草地贪夜蛾蛹从容器中取出，进行除湿，直至草地贪夜蛾蛹羽化，即可得草地贪夜蛾成虫；
步骤三，将双酰胺类杀虫剂用丙酮水溶液进行溶解，配置五个不同浓度的双酰胺类杀虫剂溶液；
步骤四，将步骤二培养的草地贪夜蛾置于培养皿中，分别对不同培养皿中的草地贪夜蛾进行步骤三配制的不同浓度双酰胺类杀虫剂溶液的滴加，一个培养皿中不进行双酰胺类杀虫剂溶液的滴加；
步骤五，将处理后的草地贪夜蛾连同培养皿置于温度为26-29℃，相对湿度为70-80％的环境中进行饲养；
步骤六，分别在饲养48h和96h时进行草地贪夜蛾状态检查，使用棉棒轻触虫体，确定草地贪夜蛾死亡状态和死亡数量；
步骤七，采用PoloPlus2.0软件进行分析，得到草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性；
所述采用PoloPlus2.0软件进行分析，得到草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性包括：
(7.1)获取草地贪夜蛾死亡数量以及致死的双酰胺类杀虫剂浓度数据，并将死亡数量转化为机率值；
(7.2)基于死亡机率值与致死的双酰胺类杀虫剂浓度数据的对数进行毒力回归曲线的绘制；
(7.3)将毒力回归曲线与标准曲线对比，即可得到的草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性；
步骤八，进行草地贪夜蛾基因的相对表达量测定，得到相对表达量在抗性种群中表达量最高的基因；
所述进行草地贪夜蛾基因的相对表达量测定包括以下步骤：
(8.1)进行草地贪夜蛾总DNA的提取以及cDNA的合成；
(8.2)设计荧光定量PCR引物；
(8.3)通过荧光定量PCR检测草地贪夜蛾不同基因的基因表达量；
(8.4)进行相对表达量的计算。


2.如权利要求1所述快速鉴定草地贪夜蛾对双酰胺类杀虫剂抗药性的方法，其特征在于，所述草地贪夜蛾复配饲料的制备方法为：
(1)将麦麸进行充分研磨，过筛，得到麦麸粉末；
(2)将纯净水进行加热至沸腾，加入可食用琼脂，搅拌，得到琼脂液；
(3)在琼脂液中加入麦麸粉末、玉米粉、葡萄糖，进行搅拌，得到混合物；
(4)在混合物中添加蜂蜜，搅拌均匀，冷却，得到草地贪夜蛾复配饲料。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏湘宁，李传瑛，章玉苹，黄少华，廖章轩，姜大卫，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，北海丹桂农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44