一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法，利用CRTL1基因表达程度控制培养软骨细胞质量，确保体外扩增培养的软骨细胞移植后在体内可以形成健康的软骨。利用本发明专利技术方法筛选得到的软骨在体内具有良好的软骨组织形成能力、修复能力。本发明专利技术方法方便快捷，为提高软骨培养质量奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法。
技术介绍
培养软骨是世界上公认的治疗软骨损伤的有效方法。培养软骨是从患者的膝盖非加重区域去少量的软骨组织，用酶消化提取软骨细胞，并对软骨细胞进行扩增后，把培养软骨移植到膝盖软骨的缺口上。那么，在体外扩增的培养软骨细胞被移植后在体内到底能否形成正常的软骨，这是保证培养软骨质量保证的重要课题。软骨细胞在体内时，软骨细胞的特异性基因的表达较高。但在体外的培养软骨细胞，软骨特异性基因AGG，COL-2，SOX-9,CRTL1的表达会随着培养软骨扩增次数的增加而降低，与此同时非特异性基因的表达会随之增加。治疗膝盖软骨损伤的培养软骨通常是把软骨细胞在体外扩增后注入膝盖关节。现有的细胞质量指标主要是细胞数量，生存率（%oflivingcells），细胞的无菌性，含杂质的量，内毒素，支原体等。目前还没有合适的指标可直接细胞在体内软骨的形成能力。如何保证培养软骨细胞质量，以确保被移植细胞能够在体内形成新的弹性软骨是培养软骨是培养软骨产品开发的痛点。我们认为虽然软骨细胞的特异性基因的表达会随着传代的增加而逐步下降，但这些基因表达只有能保持在一定水平以上就可以确保被移植的培养软骨细胞能够在体内形成新的弹性软骨。然而如何筛选出与软骨质量密切相关的特异性基因，以及如何利用特异性基因的表达程度来管控软骨细胞的质量，是本领域的一大技术难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：以GAPDH作为内参通过测量培养软骨细胞中软骨特异性基因的表达程度，来控制培养软骨细胞质量，确保培养软骨细胞移植后在体内可以形成健康的软骨。所述软骨特异性基因为CRTL1基因。培养软骨细胞的CRTL1基因表达程度大于0.060时，判定为质量良好；所述CRTL1基因表达程度=CRTL1拷贝数/GAPDH拷贝数。本专利技术的优点在于：（1）本专利技术筛选得到的软骨细胞特异性基因CRTL1与软骨质量能呈现良好的关联关系，CRTL1基因表达程度（CRTL1拷贝数/GAPDH拷贝数）大于0.032时，在3D培养条件下软骨细胞能够生成正常软骨的基质，形成软骨状组织。（2）本专利技术判定方法方便快捷，利用本专利技术方法筛选得到的软骨在体内具有良好的软骨组织形成能力、修复能力。本专利技术方法方便快捷，为提高软骨培养质量奠定基础。附图说明图1为CH6培养软骨细胞经过3D培养28日后形成的软骨状组织；A：培养28日后的3D培养软骨，B:培养28日后的软骨状组织的番红O法(SafraninO)染色结果。图2为培养软骨细胞传代次数对培养软骨细胞在体内形成软骨能力的影响；A为第3代染色结果；B为第5代染色结果；C为第9代染色结果。具体实施方式实施例1培养软骨细胞，滑膜细胞的CRTL1基因表达水平将人工关节手术的废弃软骨组织或滑膜组织切成5mm×5mm小块，用PBS液（Gibco）清洗3次后加入浓度为0.25%的胰酶/EDTA和0.2%Ⅱ型胶原酶，500mg软骨加入10mL0.25%的胰酶/EDTA，10mL0.2%Ⅱ型胶原酶，37℃消化10-20h后，通过孔径为50目筛网滤去杂质，并以350g离心5min，去上清，加含10％胎牛血清的高糖DMEM（Gibco）培养基制成细胞悬液。以5000个/cm2的细胞密度接种于75cm2摇瓶内，置于饱和湿度、37℃、8%CO2培养箱培养，每2-3天交换培养液1次。待细胞长到80-90%时，0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，按1∶5的比例传代，回收第3代细胞用于提取totalRNA供real-timePCR分析用。用NucleoSpinRNAkit（TakaraBioInc）试剂盒提供的方法从细胞中提取totalRNA，然后用PrimeScriptII1ststrandsynthesiskit（TakaraBioInc）试剂盒提供的方法合成cDNA，按照TaqManFastUniversalPCRMasterMix（ThermofisherScientific）试剂盒说明进行real-timePCR操作，分析细胞中的CRTL1，GAPDH等基因的拷贝数。使用的PCR仪器：StepOnePlus（Appliedbiosystems）扩增程序为：50℃2min；95℃10min；95℃15sec、60℃10sec，40个循环。使用PCR引物：CRTL1上游引物：5’-TGAAGGATTAGAAGATGATACTGTTGTG-3’；CRTL1下游引物：5’-GCCCCAGTCGTGGAAAGTAA-3’；GAPDH上游引物：5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’；GAPDH下游引物：5’-TAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3’；表1是3代培养后的软骨细胞和关节滑膜细胞的CRTL1基因表达程度（CRTL1拷贝数/GAPDH拷贝数）。因个体不同，CRTL1基因表达程度也随之变化。作为参考，我们也分析了滑膜细胞的CRTL1基因表达。表1的滑膜细胞CK3和CK6分别是从与软骨细胞CH3和CH6相同个体的关节滑膜组织分离出来的。与软骨细胞相比，滑膜细胞CRTL1基因表达程度要低2倍左右。表1各种Lot培养软骨细胞的CRTL1基因表达程度（CRTL1拷贝数/GAPDH拷贝数）CH1-7：软骨细胞，CK3，CK6:关节滑膜细胞实施例23D培养软骨细胞的软骨特异的基质生成能力为了检查表1中的各种培养软骨细胞有没有软骨损伤修复作用，本专利技术利用3D培养技术来模仿软骨细胞的体内环境，检验这些培养细胞是否具有软骨组织形成能力。（1）3D软骨细胞培养是利用海藻酸钠(Alginate)技术，具体方法：3代培养后的软骨细胞，经过350g×5min离心浓缩后，去掉上清。往细胞沉淀物添加2%海藻酸钠溶液，调制2×106cells/mL细胞悬浊液。把细胞悬浊液移到10ml注射器吸后，装上22G注射针，把细胞悬浊液往100mM氯化钙溶液滴下，作海藻酸钠水凝胶球，然后用生理食盐水洗3次后，移到6孔细胞培养板6wellplate（浮遊细胞培养用），添加5mL含10μg/mL硫酸庆大霉素，FBS（10%）、IGF-I(200ng/mL)、胰岛素10μg/mL)、BMP-7(400ng/mL)、抗坏血酸（25μg/mL）的高糖DMEM（Gibco），置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱培养，每2-3天交换培养液1次。（2）3D培养后的软骨细胞分析：为了分析软骨细胞的基因表达程度，以及在3D培养环境下，各种培养细胞的软骨组织形成能力，我们把培养开始（0日）及14日后的细胞回收，进行软骨细胞的基因表达以及软骨组织特异的基质生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法，其特征在于，以GAPDH作为内参通过测量培养软骨细胞中软骨特异性基因的表达程度，来控制培养软骨细胞质量，确保培养软骨细胞移植后在体内可以形成健康的软骨。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法，其特征在于，以GAPDH作为内参通过测量培养软骨细胞中软骨特异性基因的表达程度，来控制培养软骨细胞质量，确保培养软骨细胞移植后在体内可以形成健康的软骨。


2.根据权利要求1所述的一种利用软骨特异性基因表达程度控制软骨质量的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：福建华民生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35