一种光控荧光蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种光控荧光蛋白。本发明专利技术公开的光控荧光蛋白为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、并保持序列2的第29位、第94位、第167位、第10位、第35位、第40位、第70位、第196位和第2位的氨基酸残基不变且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明专利技术的光控荧光蛋白可以用于光电联合成像，也可独立地用于蛋白标记与荧光成像的领域中，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种光控荧光蛋白
本专利技术涉及生物光学成像与分子影像学
中，一种光控荧光蛋白。
技术介绍
光电联合成像技术结合了荧光成像的高特异性和电子显微成像的高分辨率，提供了互补的生物学信息。普通光学成像的分辨率(侧向分辨率约为250nm)与电镜分辨率(侧向分辨率约为2nm)的尺度相差较大，相比之下，超高分辨率荧光显微成像(最高侧向分辨率约为10nm)与电子显微成像的结合很大程度上提高了信息的匹配性和准确度。对样品的同一层切片进行电镜和光镜成像是最理想的状态，通常采取先电镜制样，再光镜成像，最后电镜成像的顺序，但电镜制样的过程往往会破坏荧光蛋白探针的生色团，给荧光成像带来困难。2014年，有人报道了在锇酸固定后仍能保留部分荧光并进行光电联合超分辨成像的光转化荧光蛋白mEos4b。其问题在于，mEos4b标记的样品仅能使用GMA树脂包埋，而GMA不能有效固定膜结构，不能对同层切片成像，连续切片时容易丢片，并且由于包埋在酸性环境下进行，在荧光成像时需用含抗光漂白成分的碱性缓冲液处理样品以恢复荧光，而这种缓冲液通常会改变GMA树脂包埋样品的超微结构。使用Epon树脂包埋能很好的解决上述问题，包括更好地保存样品的超微结构，切片时保护样品使其不易受损，连续切片时很少丢片，更适合连续切片和3D切片电镜重构，荧光成像缓冲液对其结构影响较小，在同层样品光电联合成像中更具优势等等。然而，目前并没有荧光蛋白能够在Epon树脂包埋后仍保留足够的荧光以满足超高分辨率荧光成像的要求。目前光电联合超分辨成像技术中的光镜一般指单分子定位超高分辨率荧光显微成像技术(PALM)。在该技术中，通过使用光控发光的荧光蛋白并控制光照强度，使得在任一成像时间，发光分子的分布分散且稀疏，且对于每个发光分子，能够使用高斯数学函数拟合其形态并确定其中心位置，随后不断重复成像过程，通常几万到十几万次，直至足够多的发光分子出现并被定位，叠加所有正确定位的荧光分子，即可得到最后的重构图像。可以用于单分子定位超高分辨率荧光显微成像的荧光蛋白有三类：光激活荧光蛋白，光照后发生从不亮到亮的不可逆转变；光转化荧光蛋白，光照后从一种颜色不可逆地转换为另一种颜色；光开光荧光蛋白，在亮和不亮两种状态间可逆变化的光开关荧光蛋白。光转换化荧光蛋白由于其转化前后的高荧光对比度，是PALM成像中应用最广，更新最快的荧光蛋白类别。其中，来自石珊瑚Lobophylliahemprichii的绿转红荧光蛋白EosFP是最早被用于PALM成像的光转换荧光蛋白，其转换前后的发射峰值分别为516nm和581nm，但它是四聚体。通过随机点突变，两种不同形式的二聚体和单体mEosFP最后被改造出来。但mEosFP不能在37℃成熟，限制了其在哺乳动物细胞中的应用。为了解决这一问题，研究人员将两个二聚体形式的EosFP用一个含16个氨基酸的linker串联起来，专利技术了tdEosFP。tdEosFP亮度很高，但分子量大，成熟慢，会对某些蛋白(tubulin，histones，gapjunctions)的定位产生影响。此后，McKinney等人报道了由mEosFP改良而来，能在37℃成熟的单体蛋白mEos2，但其融合特性受靶标蛋白局部浓度的影响。例如，标记局部分子浓度高的膜蛋白时，mEos2会影响膜蛋白的定位和功能。因此，在此基础上，专利技术人首先解析了mEos2的晶体结构，通过结构分析设计突变，得到了真正意义上的单体mEos3.2，在PALM成像中定位精度和标记密度均高于mEos2。使用光控荧光蛋白进行光电联合超分辨成像时，通常采用先光镜成像，再电镜制样，再电镜成像的流程。这是因为荧光蛋白一般都无法在电镜制样后仍保留荧光，对荧光破坏较大的步骤主要是锇酸固定和树脂包埋。但上述操作的问题也是显而易见的，电镜制样前后的样品形变较大，给配准带来较大困难。mEos4b的出现部分解决了这一问题，其能在1％锇酸固定和GMA树脂包埋后保留足够荧光和光转后特性，先完成PALM成像，后进行电镜成像。但从对样品的保护和超微形态的保存来说，GMA并不是最佳选择，尤其在做连续切片或者对同一层切片样品联合成像时，Epon树脂包埋更具优势。但目前并未有报道称荧光蛋白可以抵抗Epon树脂包埋。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何利用光电联合成像方法定位目的蛋白。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种蛋白质(名称为PCEM)，PCEM为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、并保持序列2的第29位、第94位、第167位、第10位、第35位、第40位、第70位、第196位和第2位的氨基酸残基中一个或多个或全部不变且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。所述标签可为下表所示标签。表：标签的序列上述A2)中的PCEM蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性(即75％-100％之间的同一性)且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。上述A2)中的PCEM蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中的PCEM蛋白质的编码基因可通过将序列3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列3所示的DNA分子编码序列2所示的PCEM蛋白质。本专利技术还提供了与PCEM相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：B1)编码PCEM的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；B6)含有B1)所述核酸分子的转基因组织、或含有B2)所述表达盒的转基因组织；B7)含有B1)所述核酸分子的转基因器官、或含有B2)所述表达盒的转基因器官。B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：b11)编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；b12)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PCEM的cDNA分子或DNA分子；b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码PCEM的cDNA分子或DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质，为如下A1)、A2)或A3)：/nA1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；/nA2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、并保持序列2的第29位、第94位、第167位、第10位、第35位、第40位、第70位、第196位和第2位的氨基酸残基中一个或多个或全部不变且具有相同功能的蛋白质；/nA3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.蛋白质，为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加、并保持序列2的第29位、第94位、第167位、第10位、第35位、第40位、第70位、第196位和第2位的氨基酸残基中一个或多个或全部不变且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。


2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因组织、或含有B2)所述表达盒的转基因组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因器官、或含有B2)所述表达盒的转基因器官。


3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：
b11)编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；
b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；
b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。


4.权利要求1所述蛋白质在作为光控荧光蛋白中...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐平勇，徐涛，张名姝，付志飞，彭鼎铭，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11