一种基于新型冠状病毒突刺蛋白S1区域预防新型冠状病毒感染的亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种基于新型冠状病毒突刺蛋白S1区域预防新型冠状病毒感染的亚单位疫苗，属于疫苗领域。所述亚单位疫苗包括新型冠状病毒突刺蛋白S1区域抗原和佐剂，通过皮下或肌肉注射施用2‑3次，用于预防新型冠状病毒。本发明专利技术所述的亚单位疫苗既能避免全长S蛋白用作新型冠状病毒疫苗潜在的ADE风险，又能保留RBD免疫原性但不引入其他病毒抗原，使免疫后产生的抗体足以中和新型冠状病毒。

【技术实现步骤摘要】
一种基于新型冠状病毒突刺蛋白S1区域预防新型冠状病毒感染的亚单位疫苗
本专利技术属于疫苗领域，特别涉及一种基于新型冠状病毒突刺蛋白S1区域预防新型冠状病毒感染的亚单位疫苗。
技术介绍
发现于2019年12月底的新型冠状病毒（Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2，SARS-CoV-2）半年之内席卷全球，截止2020年6月底已造成上千万人感染，50余万人死亡。包括克利芝（洛匹那韦/利托那韦）、羟氯喹、瑞德西韦和地塞米松在内紧急使用的药物临床上治疗新冠肺炎（coronavirusdisease2019，COVID-19）均未显示出满意效果。考虑到SARS-CoV-2的强传染性和高致病、致死率，疫苗仍是公共防御措施之外应对COVID-19的首选。多种疫苗形式包括核酸疫苗（DNA/RNA）、病毒载体疫苗、减毒/灭活疫苗和亚单位疫苗均正在进行临床评估。减毒/灭活疫苗和亚单位疫苗是已上市疫苗的常见形式（核酸疫苗目前无任何产品上市，病毒载体苗仅有针对埃博拉病毒的疫苗上市），其中减毒苗研发周期过长不足以应对目前对疫苗的迫切需求；灭活疫苗生产过程中病毒的强传染性导致的暴露风险使其对厂房条件、生产规程要求较高。另外，根据先前的冠状病毒疫苗（包括SARS-CoV和中东呼吸综合症病毒MERS-CoV）研发经验，灭活疫苗在动物实验中会导致抗体依赖性增强感染（antibody-dependentenhancementinfection，ADE），该风险曾导致美国SARS灭活疫苗临床1期实验撤销（NCT00533741）。冠状病毒的刺突蛋白（Spike，S）负责病毒和宿主细胞受体的结合（S1区域）以及介导病毒与宿主细胞的膜融合（S2区域），S蛋白抗体滴度与感染者疾病严重程度及存活率密切相关，是目前冠状病毒疫苗开发公认的首选抗原。不幸的是，全长S蛋白联合铝佐剂，免疫后虽对病毒攻击具有一定的保护作用，但均会因病毒感染诱发以嗜酸性粒细胞浸润为特点的肺部严重免疫病理。该Th2型免疫应答对有哮喘、肺阻塞等基础呼吸道疾病的接种者（比如很多老年人）存在致命危险，该风险已导致美国基于S蛋白的SARS亚单位疫苗临床1期实验撤销（NCT01376765）。仅使用冠状病毒的受体结合区域（receptorbindingdomain，RBD）用作亚单位疫苗被认为可有效降低ADE风险，但因其分子量较小（约200氨基酸），需要将其展示于其他病毒的病毒样颗粒表面（会引入非必须抗原）或制备成多聚体的形式来增强免疫原性。因此，一种既可以降低ADE风险、又具备足够免疫原性的抗原选择至关重要。
技术实现思路
针对上述存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于新型冠状病毒突刺蛋白S1区域预防新型冠状病毒感染的亚单位疫苗，既能避免全长S蛋白用作新型冠状病毒疫苗潜在的ADE风险，又能保留RBD免疫原性但不引入其他病毒抗原，使免疫后产生的抗体足以中和新型冠状病毒。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于新型冠状病毒突刺蛋白S1区域预防新型冠状病毒感染的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包括新型冠状病毒突刺蛋白S1区域抗原，其氨基酸序列如下：VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR。进一步的，所述亚单位疫苗中还包括佐剂。进一步的，所述新型冠状病毒突刺蛋白S1区域抗原是使用哺乳动物细胞、昆虫-杆状病毒系统、酵母系统表达制备的新型冠状病毒突刺蛋白S1区域。进一步的，在单针剂疫苗中，S1区域抗原的含量为5μg至500μg。进一步的，所述佐剂包括氢氧化铝佐剂，在单针剂疫苗中，佐剂的含量为0.3-3mg。进一步的，所述亚单位疫苗通过皮下或肌肉注射施用2-3次，用于预防新型冠状病毒感染。本专利技术的另一方面：所述基于新型冠状病毒突刺蛋白S1区域预防新型冠状病毒感染的亚单位疫苗在预防新型冠状病毒方面的应用。本专利技术相比现有技术的有益效果为：（1）本专利技术通过去除S蛋白中介导病毒与宿主细胞的膜融合区域S2以尽可能避免ADE风险；保留S蛋白中负责病毒和宿主细胞受体结合区域RBD的同时，保留S1区域中的N末端功能区（NTD），用以维持RBD的空间构象和与此相关的免疫原性；（2）实验证实，本专利技术所述S1蛋白免疫实验动物产生的血清抗体，可有效中和新型冠状病毒；S1蛋白免疫实验动物产生的抗体中IgG2a滴度较高，ADE风险较低。附图说明图1为本专利技术实施例1制备的诺如核心蛋白-新型冠状病毒突刺蛋白S1（S-S1）、诺如核心蛋白-新型冠状病毒受体结合区蛋白RBD（S-RBD）蛋白电泳图（A），免疫印迹鉴定结果（B）及透射电镜检测（C和D）；图2显示经实施例2间隔2周经3次肌肉注射2周后，经实施例3测得特异性针对S1抗原和RBD抗原的IgG(B)和IgA(C)抗体滴度；图3显示经实施例2间隔2周经3次肌肉注射2周后，经实施例3测得特异性针对S1抗原和RBD抗原的IgG1(A)和Ig2a(B)抗体滴度，以及经实施例4计算所得IgG1与Ig2a的比例；图4显示经实施例2间隔2周经3次肌肉注射2周后，经实施例5和6测得的新型冠状病毒中和抗体滴度。具体实施方式实施例1——抗原的制备编码新型冠状病毒S1区域（YP_009724390.1，Met1-Tyr695）和RBD区域（YP_009724390.1，Arg328-Pro本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于新型冠状病毒突刺蛋白S1区域预防新型冠状病毒感染的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗包括新型冠状病毒突刺蛋白S1区域抗原，其氨基酸序列如下：/nVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR。/n...

【技术特征摘要】
20200713 CN 20201066705721.一种基于新型冠状病毒突刺蛋白S1区域预防新型冠状病毒感染的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗包括新型冠状病毒突刺蛋白S1区域抗原，其氨基酸序列如下：
VNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTP...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘存宝，曹晗，王云飞，王丽春，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53