脐带间充质干细胞外泌体雾化液在制备治疗哮喘产品中的应用制造技术

本发明专利技术公开了脐带间充质干细胞外泌体雾化液在制备治疗哮喘产品中的应用，所述雾化液由间充质干细胞外泌体和生理盐水组成的间充质干细胞外泌体雾化液在如下任一中的应用，(1)制备降低肺气管及肺气管旁炎症的产品；(2)制备治疗哮喘的产品；(3)制备预防哮喘的产品；(4)制备缓解哮喘的产品。本发明专利技术的用于治疗哮喘的脐带间充质干细胞外泌体雾化液的制备方法，可在较短时间内取得高纯度、高密度的具有生物学活性的外泌体；制备过程中，其离心温度为0‑20℃，保证了在提取过程中外泌体的生物学活性不受影响。

【技术实现步骤摘要】
脐带间充质干细胞外泌体雾化液在制备治疗哮喘产品中的应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及脐带间充质干细胞外泌体雾化液在制备治疗哮喘产品中的应用。
技术介绍
间充质干细胞(Mesenchymalstemcells)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，源于发育早期的中胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得。近年来研究发现，干细胞在培养过程中可以向培养基中分泌包含有多种生物活性物质的外泌体。外泌体是一种直径在30-150nm的双层囊泡结构，作为机体内细胞间的信号传递物质，外泌体中包含有microRNA、信号蛋白、活性肽和细胞因子等多种生物活性物质。且有大量研究表明，干细胞外泌体拥有良好的免疫调节和组织修复等功能，在治疗烧伤、慢性阻塞性肺疾病、哮喘以及抗衰老等多种疾病方面具有极高的临床价值。哮喘是一种临床常见的以慢性呼吸道炎症、气道高反应性和气道重塑为特征的呼吸道疾病，典型的临床表现包括喘息、气促、胸闷、咳嗽在内的多种呼吸系统症状，并常常在肺功能检查时表现为呼气性气流受限。哮喘是由多种细胞包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等及细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。其临床表现为反复发作的喘息、气息、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间及凌晨发作或加重，多数患者可自行缓解或经治疗后缓解，同时伴有可变的气息受限和气道高反应性，随着病程的延长可导致一系列气道结构的改变，既气道重塑。根据GINA(全球哮喘防治指南)指南，支气管哮喘治疗主要包括吸入激素联合吸入β受体激动剂。但是很多哮喘患者尽管接受了最佳治疗，仍不能控制哮喘，严重影响患者的生活质量。近年来大量的基础实验发现在哮喘模型中，间充质干细胞外泌体可通过抗炎、促进组织细胞修复，调节免疫反应等方面发挥治疗作用，改善哮喘相关症状。目前，用于治疗哮喘的外泌体制剂通常存在外泌体提取效率不高、提取过程中损伤外泌体自身结构以及给药方式不理想等弊端。
技术实现思路
为此，本专利技术提供脐带间充质干细胞外泌体雾化液在制备治疗哮喘产品中的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术一方面提供一种间充质干细胞外泌体雾化液的制备方法，其包括：在干细胞培养基中传代培养脐带间充质干细胞，待培养细胞融合度达到80-90％后，收集上清液，分离得到外泌体溶液，将所述外泌体溶液通过0.22μm无菌过滤膜过滤后，将收集的滤液在50000-200000g转速下离心30-90min，弃上清，收集沉淀物，即为外泌体；将所述外泌体溶于生理盐水得到所述间充质干细胞外泌体雾化液。本专利技术的一个实施例中，所述传代培养间充质干细胞传至P1-P10代，培养条件为3％-8％二氧化碳、温度为36℃-39℃、湿度为85％-100％环境中恒温培养。本专利技术的一个实施例中，所述脐带间充质干细胞是将脐带剔除动静脉血管后，剪成组织匀浆块，所述组织匀浆块滤网过滤，孵育所述组织匀浆块，并加入无血清培养基培养，更换新鲜培养基培养后，用胰酶消化，得到所述脐带间充质干细胞。本专利技术的一个实施例中，所述组织匀浆块体积为0.5-3mm3。本专利技术的一个实施例中，所述滤网采用200目滤网。本专利技术的一个实施例中，所述离心的环境温度为0-20℃。本专利技术另一方面还提供上述所述的方法制备得到的间充质干细胞外泌体雾化液。本专利技术的一个实施例中，所述间充质干细胞为人原代脐带间充质干细胞。任一上述所述方法制备的间充质干细胞外泌体雾化液在如下任一中的应用，(1)制备降低肺气管及肺气管旁炎症的产品；(2)制备治疗哮喘的产品；(3)制备预防哮喘的产品；(4)制备缓解哮喘的产品，也属于本专利技术的保护范围。本专利技术中，外泌体为细胞分泌的一种直径在30-150nm之间的双层囊泡结构，内含有多种生物活性物质，如microRNA、信号蛋白、细胞因子、活性多肽等。本专利技术具有如下优点：本专利技术的用于治疗哮喘的脐带间充质干细胞外泌体雾化液的制备方法，可在较短时间内取得高纯度、高密度的具有生物学活性的外泌体；制备过程中，其离心温度为0-20℃，保证了在提取过程中外泌体的生物学活性不受影响；本专利技术通过改进脐带间充质干细胞的分离培养方法，一定程度上提高了外泌体提取的提取率和纯度；本专利技术的外泌体含量为每100ml脐带间充质干细胞上清液所含外泌体可制成0.1-10ml的外泌体雾化液，此浓度下外泌体的生物学活性良好；雾化吸入给药方案，不限于配合超声波雾化器、压缩雾化器、网式雾化器等雾化设备的使用，提高了治疗效果。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本专利技术可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本专利技术所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本专利技术所揭示的
技术实现思路
得能涵盖的范围内。图1是本专利技术实施例的P3代脐带间充质干细胞显微镜观察图；图2是本专利技术实施例的间充质干细胞流式检测结果图；图3是本专利技术实施例的外泌体直径分布范围示意图；图4是本专利技术实施例的制备的外泌体在扫描电子显微镜下的形态图；图5是本专利技术实施例的HE染色的小鼠肺部组织形态图，其中，A为对照组、B为哮喘模型组、C为人脐带间充质干细胞外泌体雾化液治疗组。具体实施方式以下由特定的具体实施例说明本专利技术的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术中，无血清干细胞培养基配方如下：无水氯化钙100-300mg/L、九水合硝酸铁0.03-0.2mg/L、氯化钾200-500mg/L、无水硫酸镁50-150mg/L、氯化钠5000-7200mg/L、无水磷酸二氢钠75-165mg/L、L-盐酸精氨酸65-105mg/L、L-盐酸胱氨酸42-86mg/L、L-谷氨酰胺320-760mg/L、甘氨酸14-32mg/L、L-盐酸组氨酸30-54mg/L、L-异亮氨酸75-165mg/L、L-亮氨酸80-125mg/L、L-盐酸赖氨酸120-165mg/L、L-甲硫氨酸12-48mg/L、L-苯丙氨酸30-80mg/L、L-丝氨酸25-62mg/L、L-苏氨酸72-125mg/L、L-色氨酸8-22.5mg/L、L-酪氨酸钠盐75-162mg/L、L-缬氨酸80-160mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞外泌体雾化液的制备方法，其特征在于包括：在干细胞培养基中传代培养脐带间充质干细胞，待培养细胞融合度达到80-90％后，收集上清液，分离得到外泌体溶液，将所述外泌体溶液通过0.22μm无菌过滤膜过滤后，将收集的滤液在50000-200000g转速下离心30-90min，弃上清，收集沉淀物，即为外泌体；/n将所述外泌体溶于生理盐水得到所述间充质干细胞外泌体雾化液。/n

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞外泌体雾化液的制备方法，其特征在于包括：在干细胞培养基中传代培养脐带间充质干细胞，待培养细胞融合度达到80-90％后，收集上清液，分离得到外泌体溶液，将所述外泌体溶液通过0.22μm无菌过滤膜过滤后，将收集的滤液在50000-200000g转速下离心30-90min，弃上清，收集沉淀物，即为外泌体；
将所述外泌体溶于生理盐水得到所述间充质干细胞外泌体雾化液。


2.如权利要求1所述的间充质干细胞外泌体雾化液的制备方法，其特征在于，
所述传代培养间充质干细胞传至P1-P10代，培养条件为3％-8％二氧化碳、温度为36℃-39℃、湿度为85％-100％环境中恒温培养。


3.如权利要求1所述的间充质干细胞外泌体雾化液的制备方法，其特征在于，
所述脐带间充质干细胞是将脐带剔除动静脉血管后，剪成组织匀浆块，所述组织匀浆块滤网过滤，孵育所述组织匀浆块，并加入无血清培养基培养，更换新鲜培养基培养后，用胰酶消化，得到所述脐带间...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海心，
申请(专利权)人：沈阳三禾生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21