用于治疗肿瘤和/或转移的抗GHFR抗体和HEGFR的组合制造技术

一种用于治疗患有肿瘤和/或转移的患者的抗HGFR抗体片段与人HGFR的细胞外部分的组合，其中：(i)抗HGFR抗体片段仅具有一个能够与人HGFR细胞外部分的表位结合的互补位，并且对HGFR具有拮抗活性，(ii)人HGFR的细胞外部分能够以稳定的方式结合HGF，并且在抗HGFR抗体片段识别的表位处包含至少一个氨基酸突变以阻止抗HGFR抗体片段与其结合，且(iii)抗HGFR抗体片段和人HGFR的细胞外部分适合于(a)以蛋白质形式或(b)以核酸形式施用于患者。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗肿瘤和/或转移的抗GHFR抗体和HEGFR的组合
本公开涉及用于治疗肿瘤和/或转移(优选转移)的治疗剂的新型组合。
技术介绍
转移性扩散是基于癌细胞破坏细胞-细胞相互作用、通过细胞外基质迁移、在其起源部位以外的组织中存活和增殖的能力。这一复杂程序(称为“侵入性生长”)的生理对应部分是胚胎发生的基础，且也是伤口愈合和成人期器官再生的原因。侵入性生长受到特定细胞外信号的紧密调控，其中之一是肝细胞生长因子(HGF)，它是MET致癌基因编码的受体的配体。在异常激活的情况中，HGF/MET信号传导在广泛的人类恶性肿瘤中驱动肿瘤的发生、发展和转移。在少数事件中，MET表现为“驱动”致癌基因，且肿瘤细胞依赖于组成性MET信号传导来生长和存活(“MET成瘾”)。这种情况依赖于遗传损伤的存在，主要是基因拷贝数增加或(较少发生的)导致组成型非配体依赖性受体激活的突变2。在这种背景中，MET抑制剂的治疗非常有效，从而在体外诱导细胞增殖的阻断和细胞周期停滞和在体内肿瘤生长的抑制。配体和受体在相同细胞内的共表达是癌症为实现持续MET激活而利用的另一策略，并且主要在非上皮性人类癌症如骨肉瘤、成胶质细胞瘤和多发性骨髓瘤中被描述。然而，在大多数情况下，肿瘤中的MET异常激活源于由野生型基因的转录上调导致的受体过表达，从而触发癌细胞对配体刺激的敏化3。在后一种情况下，MET信号传导(其导致促侵入和抗细胞凋亡反应)被癌细胞用作绕过胁迫条件并增强恶性表型的策略(“MET权宜(METexpedience)”6)。在不存在特定遗传损伤的情况下，MET并非肿瘤生长绝对必要的，但配体的存在维持了受体激活，从而增强了恶性表型。最后，MET在成胶质细胞瘤中表现为癌症“干-祖”细胞的功能性标志物8，并在结肠直肠癌和乳腺癌中支持“干”表型12，15。此外，已证明基质来源的HGF维持结肠直肠癌干细胞的WNT自我更新途径，并促进结肠癌起始细胞的增殖，从而触发对于抗EGFR疗法的抗性27。已经设计了且目前正在研究靶向MET或HGF的多种策略——小分子抑制剂、抗体或重组蛋白。其中，MvDN30抗体是单价嵌合Fab片段，其结合MET的细胞外结构域，从而诱导受体从细胞表面的蛋白水解切割(“脱落”)21，28。DecoyMET是包含MET的整个细胞外区域的重组可溶性受体；且当通过慢病毒载体技术17或作为Fc融合蛋白7，26表达时，其以高亲和力结合HGF并在体外和体内抑制配体驱动的生物学活性。如在大多数生物系统中，攻击信号转导链中的单一元素不太可能导致反应的完全关闭。因此，在MET的情况中，每个分子从不会达到100％的抑制，从而遗留对HGF刺激敏感的残余活性。
技术实现思路
本公开的目的是提供可用于治疗肿瘤患者的抗肿瘤剂的新型组合。根据本专利技术，上述目的由于特别地在随后的权利要求中重现的主题得以实现，该权利要求被理解为构成本公开的组成部分。本专利技术提供了抗肝细胞生长因子受体(HGFR)抗体片段与人HGFR的细胞外部分的组合，其用于治疗患有肿瘤和/或转移(优选转移)的患者，其中：(i)抗HGFR抗体片段仅具有一个能够与人HGFR细胞外部分的表位结合的互补位，并且对HGFR具有拮抗活性，(ii)人HGFR的细胞外部分能够以稳定的方式与肝细胞生长因子(HGF)结合、并且在抗HGFR抗体片段识别的表位内包含至少一个氨基酸突变以阻止抗HGFR抗体片段与其结合，并且(iii)抗HGFR抗体片段和人HGFR的细胞外部分适合于(a)以蛋白质形式或(b)以核酸形式施用于患者。附图说明现在将参考附图，仅通过说明性和非限制性的实例详细描述本专利技术，其中：-图1.不结合DN30抗体的突变decoyMET受体的产生。(A)人、小鼠、大鼠和狗MET的第三和第四IPT结构域的氨基酸序列的比较。仅在小鼠序列中发生变化的残基以粗体，在黑色背景上的白色突出显示，也(或仅)在大鼠或狗序列中发生变化的氨基酸以粗体突出显示。仅显示了IPT-3/IPT-4边界。(B)携带单个氨基酸置换的DecoyMET受体与DN30抗体一起孵育。复合物用蛋白A(其与抗体结合)免疫沉淀，并用与诱饵(decoy)中的strep-标签结合的HRP偶联streptactin显示(左图)。30μl用于免疫沉淀的标准化上清液在SDSPAGE上运行以验证decoyMET受体负载(右图)。(C)ELISA结合分析。DN30mAb在液体相中，野生型decoyMET或decoyMETK842E在固体相中。使用HRP偶联抗小鼠抗体检测抗体结合。OD，450nm处的光密度。每个点为三次重复的值的平均值±SD。-图2.DecoyMETK842E以高亲和力结合HGF并抑制HGF诱导的MET磷酸化。(A)ELISA结合分析。野生型decoyMET或decoyMETK842E处于固体相中；增加浓度的HGF添加到液体相中。使用生物素化的抗HGF抗体检测HGF结合。每个点为重复三次的值的平均值±SD。(B)HGF诱导的MET磷酸化。A549细胞与野生型decoyMET或decoyMETK842E(2μM)一起孵育，并用HGF(50ng/ml)刺激。用抗phosphoMET(上图)、抗MET抗体(中图)或抗黏着斑蛋白抗体(下图)对总细胞裂解物进行免疫印迹。p145，MET的成熟形式；p190，MET的单链前体；p117，黏着斑蛋白。-图3.MvDN30和DecoyMETK842E协作以降低HGF诱导的MET磷酸化和MET驱动的生物学活性。(A)HGF诱导的MET磷酸化。A549人肺腺癌细胞与2μMdecoyMETK842E、125nMMvDN30或两者的组合一起孵育，并用或不用50ng/mlHGF刺激。总细胞裂解物用抗phosphoMET(上图)、抗MET抗体(中图)或抗黏着斑蛋白(下图)进行免疫印迹。p145，MET的成熟形式；p190，MET的单链前体；p117，黏着斑蛋白。(B)HGF诱导的ERK和AKT磷酸化。A549人肺腺癌细胞与500nMMvDN30、2μMdecoyMETK842E或两者的组合一起孵育，并用或不用100ng/mlHGF刺激。总细胞裂解物用抗phosphoERK、抗ERK、抗phosphoAKT、抗AKT、抗GAPDH进行免疫印迹。p42/44，ERK；p60，AKT；p36，GAPDH。(C)通过自分泌HGF刺激维持的非锚定依赖性生长。表达HGF和MET蛋白两者的U87-MG人成胶质细胞瘤细胞用单独或组合的0.5μMMvDN30或1μMdecoyMETK842E处理。图表显示了每种处理与未处理的对照相比的平均集落生长的百分比。(D)通过旁分泌HGF刺激维持的非锚定依赖性生长。用30ng/mlHGF刺激A549细胞，并用单独或组合的1μMMvDN30或1μMdecoyMETK842E处理。图表显示了每种处理与HGF刺激的对照相比的平均集落生长的百分比。(E)Transwell侵袭试验。用12.5ng/ml的HGF刺激HPAF-II人胰腺癌细胞，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗肝细胞生长因子受体(HGFR)抗体片段与人HGFR的细胞外部分的组合，其用于治疗患有肿瘤和/或转移，优选转移，的患者，其中：/n(i)所述抗HGFR抗体片段仅具有一个能够与所述人HGFR的细胞外部分的表位结合的互补位，并且对HGFR具有拮抗活性，/n(ii)所述人HGFR的细胞外部分能够以稳定的方式与肝细胞生长因子(HGF)结合、并且在所述抗HGFR抗体片段识别的所述表位内包含至少一个氨基酸突变以阻止所述抗HGFR抗体片段与其结合，且/n(iii)所述抗HGFR抗体片段和所述人HGFR的细胞外部分适合于(a)以蛋白质形式或(b)以核酸形式施用于所述患者。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180322 IT 1020180000038751.一种抗肝细胞生长因子受体(HGFR)抗体片段与人HGFR的细胞外部分的组合，其用于治疗患有肿瘤和/或转移，优选转移，的患者，其中：
(i)所述抗HGFR抗体片段仅具有一个能够与所述人HGFR的细胞外部分的表位结合的互补位，并且对HGFR具有拮抗活性，
(ii)所述人HGFR的细胞外部分能够以稳定的方式与肝细胞生长因子(HGF)结合、并且在所述抗HGFR抗体片段识别的所述表位内包含至少一个氨基酸突变以阻止所述抗HGFR抗体片段与其结合，且
(iii)所述抗HGFR抗体片段和所述人HGFR的细胞外部分适合于(a)以蛋白质形式或(b)以核酸形式施用于所述患者。


2.根据权利要求1所述的用途的所述抗HGFR抗体片段与所述人HGFR的细胞外部分的组合，其中所述抗HGFR抗体片段包含一个轻链可变域(VL)和一个重链可变域(VH)，其中所述轻链和重链可变域是非人的或人源化的，并且其中所述轻链可变域包含具有SEQIDNo.:1至3中所示的氨基酸序列的互补决定区(CDR)，和所述重链可变域包含具有SEQIDNo.:4-6中所示的氨基酸序列的CDR。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途的所述抗HGFR抗体片段与所述人HGFR的细胞外部分的组合，其中所述抗HGFR抗体片段进一步包含一个人轻链恒定域和一个人重链CH1恒定域，所述轻链可变域沿N末端至C末端方向与所述人轻链恒定域融合，并且所述重链可变域沿N末端至C末端方向与所述人重链CH1恒定域融合。


4.根据权利要求3所述的用途的所述抗HGFR抗体片段与所述人HGFR的细胞外部分的组合，其中所述抗HGFR抗体片段为单链Fab片段。


5.根据前述权利要求中任一项所述的用途的所述抗HGFR抗体片段与所述人HGFR的细胞外部分的组合，其中所述人HGFR的细胞外部分包含SEMA、PSI、IPT-1、IPT-2、IPT-3和IPT-4结构域。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途的所述抗HGFR抗体片段与所述人HGFR的细胞外部分的组合，其中所述人HGFR的细胞外部分包含如SEQIDNo.:19中所示的序列，其中SEQIDNo.:19的797位和875位之间的至少一个氨基酸被突变以阻止所述抗HGFR抗体片段与其结合。


7.根据前述权利要求中任一项所述的用途的所述抗HGFR抗体片段与所述人HGFR的细胞外部分的组合，其中所述人HGFR的细胞外部分具有SEQIDNo.:20中所示的序列。


8.根据前述权利要求中任一项所述的用途的所述抗HGFR抗体片段与所述人HGFR的细胞外部分的组合，其中：
(i)所述抗HGFR抗体片段沿N末端至C末端方向通过接头与所述人HGFR的细胞外部分结合，从而产生抗HGFR抗体片段-接头-人HGFR的细胞外部分融合蛋白；或者
(ii)所述人HGFR的细胞外部分沿N末端至C末端方向通过接头与所述抗HGFR抗体片段结合，从而产生人HGFR的细胞外部分-接头-...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·巴西利克，E·维格纳，P·M·科蒙利奥，
申请(专利权)人：美迪斯精密药业有限公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT