一种定量检测人消化道内短链脂肪酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种定量检测人消化道内短链脂肪酸的方法，包括以下步骤：采用GC检测的方法对不同浓度短链脂肪酸标准品溶液进行测定，记录短链脂肪酸标准品溶液的色谱图和峰面积，进行线性回归分析，绘制得到标准曲线；在粪便悬液中分别加入高、中、低三个浓度的短链脂肪酸标准品溶液得到混合溶液，本发明专利技术的方法准确度高，精确度和灵敏度好，杂质较少，作为人肠道内短链脂肪酸的含量检测方法，对短链脂肪酸在人体内的代谢分布检测提供了很好的指导意义；本发明专利技术针对常规的GC法进行了改进，延迟了出峰时间，增加了各峰之间的分离度，使得目标药物峰的灵敏度增高，与原有GC方法相比，回收率提高。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测人消化道内短链脂肪酸的方法
本专利技术涉及定量检测
，具体涉及一种定量检测人消化道内短链脂肪酸的方法。
技术介绍
短链脂肪酸(SCFAs)主要由不可消化碳水化合物的结肠发酵形成，但少量支链SCFAs也可由不可消化蛋白质形成虽然乙酸、丙酸和丁酸被认为是形成的最重要的SCFAs，但粪便中也可发现异丁酸、正戊酸、异戊酸、己酸和庚酸，如大量的乳酸和琥珀酸。结肠中的SCFAs是粘膜细胞的重要营养素，可能刺激结肠菌的增殖并增加血液流量。丁酸是一种特殊的酸，这种酸可能在结肠疾病的预防和治疗中起到关键作用。大量SCFAs的产生还可能刺激人体对水和矿物质的吸收，从而更快地从腹泻中恢复并预防矿物质缺乏。SCFAs也可能具有代谢作用，并且已经证明丙酸可能抑制肝脏中胆固醇的合成不同类型的碳水化合物产生不同数量和模式的SCFAs，可能起作用的因素是碳水化合物的组成和分子量。为了评估膳食成分对健康受试者和患有结肠疾病的患者产生SCFAs的影响，关键是要有一种有效且廉价的分析方法，能够在各种体液(如粪便)中识别和定量SCFAs。此外，开发对环境影响最小的方法也很重要。SCFAs已通过多种技术进行定量，包括酶法，气相色谱法，液相色谱法，离子色谱法，薄层色谱法、毛细管电泳和稳定同位素示踪技术，在各种方法中，气相色谱法是分析超临界流体的最常用方法，因为它具有分辨率高、灵敏度高和仪器便宜等优点。以前研究SCFAs的气相色谱分析时，有机溶剂萃取、真空蒸馏、超过滤、净化和捕集技术和固相微萃取是常用的清洁预处理方法。此外，SCFAs的衍生化通常也作为必要的预处理进行，并且已经使用了不同的试剂，尽管这些预处理已经产生了良好的净化效果和火焰电离检测器的更高响应，但它们相对比较耗时，也可能降低回收率，并影响方法的准确性和重复性，此外，在上述大多数方法中，使用了大量对环境和人体健康有害的有机溶剂和试剂，目前需要一种简单、环保的方法来测定含少量预处理的短链脂肪酸。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种定量检测人消化道内短链脂肪酸的方法，具有准确度高，精确度和灵敏度好，简单和环保，回收率提高等优点，详见下文阐述。为实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供的一种定量检测人消化道内短链脂肪酸的方法，包括以下步骤：步骤1：采用GC检测的方法对不同浓度短链脂肪酸标准品溶液进行测定，记录八种短链脂肪酸标准品溶液的色谱图和峰面积，进行线性回归分析，绘制得到各自的标准曲线；步骤2：在粪便悬液中分别加入高、中、低三个浓度的短链脂肪酸标准品溶液得到各个浓度的混合溶液，将所述混合溶液按照净化提取方法进行净化提取后进行GC检测；步骤3：对步骤2进行重复操作，记录并计算平均值，计算日内相对误差即为日内变异系数；计算平均值和相对误差，得到日间变异系数；准确度和精密度分别用回收率和变异系数来表示；回收率采用单点校准法计算，公式如下：公式中：X表示回收率；A表示峰面积；V表示待测提取液吹干后定容体积，单位是mL；As表示短链脂肪酸标准品溶液的峰面积；W表示检测的混合溶液体积，单位是mL；步骤4：将粪便悬液按照净化提取方法进行净化提取后进行GC检测，记录色谱图和峰面积，并以步骤(4)所得的线性回归方程分别计算出不同时间点取样所得粪便悬液中八种脂肪酸的含量。作为优选，步骤1包括选取7份不同浓度的短链脂肪酸标准品溶液进行测定。作为优选，步骤3包括：步骤31：同一天对步骤2进行重复操作5次，取平均值，计算日内相对误差即为日内变异系数；步骤32：对步骤31进行重复操作5天，计算平均值和相对误差，得到日间变异系数。作为优选，所述GC检测的条件如下：色谱柱：DB-FFAP125-3237，30m×0.53mm×0.50um；载气采用高纯氮气N2，气体流速为14.4mL/min；进样口采用分流进样，进样时间为1.0min，温度为200℃；检测器：FID检测器，温度240℃；流速：H230mL/min，空气300mL/min；尾吹气采用N2，流速为20mL/min进样量为1μL；升温程序方案为：温度为100℃时，升温速率是0℃/min，保留时间1min；温度为180℃时，升温速率是8℃/min，保留时间1min；温度为200℃时，升温速率是20℃/min，保留时间2min。作为优选，所述净化提取方法为向粪便悬液中加6mol/L的盐酸从而将PH值调整为2-3，室温条件下进行涡旋震荡10min，5000r/min离心20min，取上清液。有益效果在于：1、本专利技术的方法准确度高，精确度和灵敏度好，杂质较少，作为人肠道内短链脂肪酸的含量检测方法，对短链脂肪酸在人体内的代谢分布检测提供了很好的指导意义；2、本专利技术针对常规的GC法进行了改进，升温程序变成初始温度100℃，维持1min，8℃/min升至180℃，保持1.0min，然后在20℃/min升至200℃，最后在200℃下保持2min，延迟了出峰时间，增加了各峰之间的分离度，使得目标药物峰的灵敏度增高，与原有GC方法相比，回收率提高；3、本专利技术中的前处理提取液HCL的浓度为6mol/L，确保SCFAs完全质子化，与离子化的SCFAs相比，质子化SCFAs被水萃取的程度更大，经过改进使样品中杂质减少，检测的精确度和灵敏度高，回收率达到检测要求。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为短链脂肪酸标准品的色谱图；图2为人粪便悬液样品色谱图；图3为乙酸、丙酸、正丁酸的标准曲线和回归方程；图4为正戊酸和异戊酸的标准曲线和回归方程；图5为异丁酸的标准曲线和回归方程；图6为己酸的标准曲线和回归方程；图7为庚酸的标准曲线和回归方程；图8为对比例1的色谱图；图9为对比例2的色谱图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。实施例一：参见图1-图7所示，本专利技术提供了一种定量检测人消化道内短链脂肪酸的方法，包括以下步骤：步骤1：准备短链脂肪酸标准品溶液和待检测的样品提取液，制备短链脂肪酸标准品储备液：精密称取乙酸标准品240.0mg、丙酸296.0mg、丁酸352.4mg、戊酸204.3mg、异戊酸204.3mg、异丁酸88.1mg、己酸58.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测人消化道内短链脂肪酸的方法,其特征在于,包括以下步骤：/n步骤1：采用GC检测的方法对不同浓度短链脂肪酸标准品溶液进行测定，记录八种短链脂肪酸标准品溶液的色谱图和峰面积，进行线性回归分析，绘制得到各自的标准曲线；/n步骤2：在粪便悬液中分别加入高、中、低三个浓度的短链脂肪酸标准品溶液得到各个浓度的混合溶液，将所述混合溶液按照净化提取方法进行净化提取后进行GC检测；/n步骤3：对步骤2进行重复操作，记录并计算平均值，计算日内相对误差即为日内变异系数；计算平均值和相对误差，得到日间变异系数；准确度和精密度分别用回收率和变异系数来表示；回收率采用单点校准法计算，公式如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种定量检测人消化道内短链脂肪酸的方法,其特征在于,包括以下步骤：
步骤1：采用GC检测的方法对不同浓度短链脂肪酸标准品溶液进行测定，记录八种短链脂肪酸标准品溶液的色谱图和峰面积，进行线性回归分析，绘制得到各自的标准曲线；
步骤2：在粪便悬液中分别加入高、中、低三个浓度的短链脂肪酸标准品溶液得到各个浓度的混合溶液，将所述混合溶液按照净化提取方法进行净化提取后进行GC检测；
步骤3：对步骤2进行重复操作，记录并计算平均值，计算日内相对误差即为日内变异系数；计算平均值和相对误差，得到日间变异系数；准确度和精密度分别用回收率和变异系数来表示；回收率采用单点校准法计算，公式如下：



公式中：X表示回收率；A表示峰面积；V表示待测提取液吹干后定容体积，单位是mL；As表示短链脂肪酸标准品溶液的峰面积；W表示检测的混合溶液体积，单位是mL；
步骤4：将粪便悬液按照净化提取方法进行净化提取后进行GC检测，记录色谱图和峰面积，并以步骤2所得的线性回归方程分别计算出不同时间点取样所得粪便悬液中八种脂肪酸的含量。


2.根据权利要求1所述一种定量检测人消化道内短链脂肪酸的方法，其特征在于：步骤1包括选取7份不同浓度的短链脂肪酸标准品溶液进行测定。


3.根据权利要求1所述一种定量检测人消化道内短链脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝海红，刘春贝，王俊豪，陶燕飞，黄玲利，王旭，陈冬梅，彭大鹏，王玉莲，潘源虎，谢书宇，程古月，刘振利，瞿伟，谢长清，黄啸，郭金丽，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42