适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中环丙氨嗪的方法技术

本发明专利技术涉及一种适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中环丙氨嗪的方法，该方法包括以下步骤：1)制备包含核酸适配体包裹的纳米金颗粒、TMB、H

【技术实现步骤摘要】
适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中环丙氨嗪的方法
本专利技术属于牛奶中环丙氨嗪检测
，涉及一种利用核酸适配体修饰的纳米金颗粒催化TMB/H2O2，通过肉眼/紫外吸收光谱检测牛奶中环丙氨嗪的方法。
技术介绍
环丙氨嗪(Cyromazine，Cyr)的化学名为2-环丙胺基-4,6-二氨基三嗪，与阿特拉津、西玛津、莠灭津、扑灭津等同属三嗪类或均三氮苯化合物，是一种高效抑制昆虫生长剂、杀寄生虫类杀虫剂，在畜禽养殖过程中作为饲料添加剂使用。研究表明环丙氨嗪进入动物体内绝大部分以原药或代谢物形式通过奶或者粪尿排泄，随后再经由畜禽粪便暴露在土壤和水环境中。土壤或水环境中的环丙氨嗪通过环境转归再次进入食物链，对不同营养级生物和人体的健康造成潜在隐患。环丙氨嗪在动物和植物体内经脱烷基化作用代谢为三聚氰胺(Melamine，Mel)，而三聚氰胺的主要代谢产物为三聚氰酸(Cyanuricacid，CA)、三聚氰酸一酰胺(Ammelide，Amd)和三聚氰酸二酰胺(Ammeline，Amn)。长期摄入三聚氰胺会导致膀胱结石，使膀胱癌的发生率明显提高。根据环丙氨嗪及其代谢产物三聚氰胺在食品中的限量标准要求，目前常用于环丙氨嗪及其代谢产物残留检测的方法有容量分析法；色谱分析方法，包括高效液相色谱法；免疫化学分析法；光学分析法等。在GB29704-2013中采用超高效液相色谱-串联质谱法来测定动物性食品中环丙氨嗪的残留。这些方法一般需要进行复杂的样品前处理，仪器价格昂贵，检测成本高，且方法操作复杂，需要经过专门训练的人员才能操作，不能完全满足对牛奶中环丙氨嗪残留快速筛查的检测需要。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了提供一种利用核酸适配体包裹的纳米金颗粒催化TMB/H2O2迅速变色所产生的溶液颜色变化，来检测牛奶中环丙氨嗪(Cyr)的方法。其中，核酸适配体(Apt)通过共价键作用包裹纳米金(AuNPs)颗粒，可以模拟过氧化物酶的催化活性催化四甲基联苯胺/双氧水(TMB/H2O2)发生显色反应，形成稳定检测液。本专利技术方法具有高灵敏度、选择性好、低成本等优势。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中环丙氨嗪的方法，该方法包括以下步骤：1)制备包含核酸适配体包裹的纳米金颗粒、TMB、H2O2的检测液；2)对牛奶样品进行前处理；3)将前处理后的牛奶样品与步骤1)中的检测液混合，得到混合液，根据混合液颜色的变化和/或吸光度的变化，判断牛奶样品中环丙氨嗪的含量；步骤1)中，所述的核酸适配体的序列为5’-GGTTGGTTGGTTGGTTTT-3’。进一步地，步骤1)中，所述的纳米金颗粒的粒径为15-20nm。进一步地，步骤1)中，所述的检测液的制备方法为：将核酸适配体溶液、纳米金颗粒溶液混合后，在28-32℃下反应25-35min，得到核酸适配体包裹的纳米金颗粒，之后加入TMB溶液、H2O2溶液并充分混合均匀。进一步地，所述的核酸适配体溶液的浓度为35-45nmol/L，所述的TMB溶液的浓度为200-240nmol/L，所述的H2O2溶液的浓度为210-270mmol/L。进一步地，步骤2)中，牛奶样品的前处理过程为：将牛奶样品与醋酸混合后静置3-8min，之后离心并取上清液，再调节pH至7.5-8.5。进一步地，步骤3)中，利用紫外分光光度计测定混合液的吸光度，并根据环丙氨嗪标准曲线得到牛奶样品中环丙氨嗪含量。进一步地，所述的环丙氨嗪标准曲线的绘制过程为：3-1)将不同浓度的环丙氨嗪标准液分别加入至多个容器中，并在每个容器中加入步骤1)中的检测液，混合均匀后反应10-20min；3-2)利用紫外分光光度计分别测定步骤3-1)中各溶液在520nm和650nm处的吸光度值，并计算二者比值，即A650/520；3-3)以不同浓度的环丙氨嗪与相应的A650/520作图，绘制出环丙氨嗪标准曲线。进一步地，根据混合液的A650/520，在环丙氨嗪标准曲线上查得牛奶样品中环丙氨嗪含量。或者，步骤3)中，将混合液置于96孔板中，根据混合液颜色的变化判断牛奶样品中环丙氨嗪的含量。进一步地，所述的牛奶中，环丙氨嗪的含量为0-0.5ppm。本专利技术的原理为：适配体修饰的AuNPs颗粒溶液为酒红色，且在520nm处有最强吸收峰。适配体修饰的AuNPs颗粒拥有类似过氧化物酶的催化活性，能够催化TMB/H2O2体系发生显色反应。TMB含有两个苯环结构，是无色透明溶液；当TMB被催化氧化后，其二苯氨基上的N原子失去一个电子形成阳离子基后，此时TMB带有正电，在370nm和650nm处分别有一个强的吸收峰，且溶液由无色变为蓝色。在存在H2O2条件下，AuNPs可催化H2O2形成·OH和·OOH等自由基，·OH和·OOH具有很强的夺电子能力，可夺取TMB氨基N上的H原子，使反应溶液由无色变为淡蓝色。本专利技术所用的适配体包裹的AuNPs颗粒催化TMB/H2O2反应能力比AuNPs单独催化能力强，会使溶液颜色变为深蓝色；而当体系中含有环丙氨嗪时，适配体首先与环丙氨嗪发生特异性反应，此时处于自由状态的AuNPs催化能力较弱，溶液颜色变浅，且溶液颜色随着环丙氨嗪浓度的增加逐渐减弱。与现有技术相比，本专利技术提供了一种利用核酸适配体修饰纳米金(AuNPs)催化四甲基联苯胺/双氧水(TMB/H2O2)迅速变色的特性，开发出一种生物传感器比色法，通过肉眼及紫外分光光度计检测牛奶中环丙氨嗪。其中，适配体修饰的AuNPs颗粒溶液为酒红色，且在520nm处有最强吸收峰。当核酸适配体修饰的AuNPs颗粒催化TMB/H2O2后，溶液显深蓝色，且在650nm处有最大吸光值；但当反应体系存在环丙氨嗪时，适配体首先与环丙氨嗪发生特异性反应，此时处于自由状态的AuNPs催化能力较弱，溶液颜色变浅，且溶液颜色随着环丙氨嗪的增加逐渐减弱，溶液在650nm与520nm处的吸光值比值，即A650/520的变化与体系中环丙氨嗪的浓度在一定范围内呈线性关系，因此可用于环丙氨嗪的检测。在最优检测条件下，对环丙氨嗪的检测线性范围为0-0.5ppm，线性相关系数为0.9539，线性回归方程为y＝-0.4416x+0.8933。本专利技术操作简便，无需大型仪器，灵敏度高，特异性高，反应迅速，可用于牛奶中环丙氨嗪的检测。附图说明图1为本专利技术检测环丙氨嗪的原理示意图；图2为本专利技术中核酸适配体浓度对检测体系的影响；图3为本专利技术中TMB浓度对检测体系的影响；图4为本专利技术中H2O2浓度对检测体系的影响；图5为本专利技术中环丙氨嗪浓度与吸光度的关系(即标准曲线)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。本实施例以本专利技术技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1：<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/n1)制备包含核酸适配体包裹的纳米金颗粒、TMB、H

【技术特征摘要】
1.适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)制备包含核酸适配体包裹的纳米金颗粒、TMB、H2O2的检测液；
2)对牛奶样品进行前处理；
3)将前处理后的牛奶样品与步骤1)中的检测液混合，得到混合液，根据混合液颜色的变化和/或吸光度的变化，判断牛奶样品中环丙氨嗪的含量；
步骤1)中，所述的核酸适配体的序列为5’-GGTTGGTTGGTTGGTTTT-3’。


2.根据权利要求1所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的纳米金颗粒的粒径为15-20nm。


3.根据权利要求1所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的检测液的制备方法为：将核酸适配体溶液、纳米金颗粒溶液混合后，在28-32℃下反应25-35min，得到核酸适配体包裹的纳米金颗粒，之后加入TMB溶液、H2O2溶液并充分混合均匀。


4.根据权利要求3所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，所述的核酸适配体溶液的浓度为35-45nmol/L，所述的TMB溶液的浓度为200-240nmol/L，所述的H2O2溶液的浓度为210-270mmol/L。


5.根据权利要求1所述的适配体包裹AuNPs催化TMB/过氧化氢检测牛奶中环丙氨嗪的方法，其特征在于，步骤2)中，牛奶样品的前处理过程为：将牛奶样品与醋酸混...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢海波，费雪莲，郑博文，李欣悦，谷佳宇，胡晓钧，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：上海;31