一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，包括103对引物或包含其中部分引物的组合，每对引物的正向引物与反向引物序列均包括扩增引物对，以及与所述扩增引物对5’端连接的其他序列；每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列选自SEQ ID NO.1～206所示的序列，优选地，为所述序列其中的18‑25个碱基序列。本发明专利技术精选22个肺癌或结直肠癌相关基因的突变热点区域，可检测低起始量或低质量的FFPE样本，也可检测ctDNA样本，满足肺癌、结直肠癌的早筛、诊断、用药、预后的一般需要。

【技术实现步骤摘要】
一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用。
技术介绍
下一代测序技术(Next-GenerationSequencing，NGS)，又称二代测序技术，是近年来兴起的可以一次对数十万乃至数亿条DNA分子进行测序的高通量检测技术，目前已广泛地应用于产前检测，肿瘤突变分析和用药指导，病原体微生物筛查等领域。Illumina平台现在是国内最常用的NGS测序仪，市场占有率较高。IonTorrent平台和国产的MGI平台也各自具有独特的优点，国内的应用比率也在稳步增长中。进行NGS测序前，通常需要先对样本DNA的特定区域进行富集和扩增，这个过程称为文库构建。目前主流的建库技术包括两种：探针杂交捕获技术和多重PCR技术。杂交捕获技术的优点是探针序列的设计难度较低，一套探针库适合多种类型的样本，因此是国内主流的建库技术。但是杂交捕获的建库流程比较复杂，经常耗时需48小时甚至更长，而且整体成本高；同时由于建库之前通常需要对组织样本进行超声、酶解等预处理，因此对样本的起始量和质量都有较多的要求。相比之下，多重PCR技术无需对样本进行预处理，较少量的样本或者一定程度降解的样本也可使用，适合临床上绝大部分情况；同时建库流程简单，数小时即可完成，总体成本也较低。但多重PCR技术对扩增引物池的设计提出了较高的要求，稍有差错就容易产生大量引物二聚体导致目的片段急剧减少，或者不得不分管操作，削弱了原本具有的优势。目前国内基于多重PCR的建库技术以转移ThermoFisher(赛默飞)的AmpliSeq系列试剂为主，自研的产品尚处于空白状态。肿瘤患者基因检测过程中，最常见的是样本类型是石蜡包埋样本(Formalin-FixedandParaffin-Embedded，FFPE)。FFPE样本有以下一些特点：一是由于该型样本在制作过程中需要使用福尔马林处理，因此样本中的DNA或多或少都存在一定程度的片段化现象，制作过程中福尔马林处理时间过长，或者保存年限过久的样本，其片段化程度尤其严重；二是FFPE样本通常是由手术切离组织或者细针穿刺组织条制作而来，总量有限，使用时受到一定的限制。综上所述，如何克服FFPE样本输入量和质量的限制，是评判NGS检测技术的重要因素。液体活检(LiquidBiopsy)是收集外周血中从肿瘤脱落的循环肿瘤细胞(CTC)、外泌体(Exosome)，或是提取肿瘤组织凋亡释放到血液中的循环肿瘤DNA(ctDNA)进行基因检测的技术。与传统的肿瘤组织手术取样或穿刺取样相比，液体活检具有创伤小，时效性高，能克服肿瘤异质性(可反映肿瘤整体而不仅是取样局部的信息)等特点，在癌症早筛、疗效评估、复发监测等领域可以发挥重要作用。制备完成的文库在NGS测序之前还需要在末端连接上可被测序仪识别的DNA接头，其中含有测序引物结合位点，用于区分不同样本的Barcode，某些情况下还有区分样本中不同DNA分子的UID(uniqueidentifier)等。其中UID片段是由6-18个随机碱基序列(A、G、C或T)组成的分子标记，在扩增ctDNA样本时，可以为每一条ctDNA分子带上不同的独特序列标记，减少由于扩增错误带来的测序背景噪音。由于各测序仪厂商加接头的原理、试剂、以及Barcode、UID片段的序列、长度都有所差别，故而设计在一种测序平台上使用的文库构建试剂(杂交捕获探针库/多重PCR引物池)通常不适合在其他平台上使用，造成了一定的不便。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物及其应用，是根据NCCN指南、FDA/NMPA指南，结合多个权威数据库，精选22个肺癌或结直肠癌相关基因的突变热点区域，满足肺癌早筛、诊断、用药、预后的一般需要。扩增子的比对率、中靶率和均一度都较好。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，包括103对引物或包含其中部分引物的组合，每对引物的正向引物与反向引物序列均包括扩增引物对，以及与所述扩增引物对5’端连接的其他序列；每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列选自SEQIDNO.1～206所示的序列。作为本专利技术的进一步改进，每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列为所述序列其中的18-25个碱基序列。本专利技术所述的引物组合物共计206条，又分为两组各103条：第一组引物3’端DNA序列分别如SEQID1～103所示，5’端DNA序列如SEQID207所示；第二组引物3’端DNA序列分别如SEQID104～206所示，5’端DNA序列如SEQID208所示，中间可选择性地连入6-18个碱基的UID序列。该引物组合物可通过多重PCR的方法，特异性地扩增肺癌患者DNA样本中多个肺癌或结直肠癌相关基因的热点区域，可测的突变类型包括点突变(SNPs)和插入/缺失(In_dels)。该引物组合物的整体设计使得对低样本输入量和中重度片段化的FFPE样本的检测成为可能。引物组合物中的UID序列可使每条DNA分子具有唯一的分子标签，保证测序之后可以追溯到原始的DNA模板，从而降低背景噪音，排除假阳性突变。因此该引物组合物既可以检测肿瘤组织样本，又适用于液体活检。作为本专利技术的进一步改进，所述扩增引物对的正向引物包括SEQIDNO.207所示的序列，优选地，为所述序列其中的16-25个碱基序列。作为本专利技术的进一步改进，所述扩增引物对的反向引物包括SEQIDNO.208所示的序列，优选地，为所述序列其中的16-25个碱基序列。本专利技术进一步保护一种上述的肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物在检测肺癌或结直肠癌突变基因中的应用。本专利技术进一步保护一种用于肺癌或结直肠癌基因检测的试剂，包括上述的引物组合物。作为本专利技术的进一步改进，还包括三对接头中的至少一对，所述三对接头分别对应Illumina、IonTorrent、MGI三种测序平台，所述接头内部含有与上述的序列配对的DNA片段。本专利技术的另一个目的在于提供一种试剂，包括上文所述的引物组合物，还包括三种接头。三种接头分别对应Illumina、IonTorrent、MGI三种测序平台，3’端可分别与上述引物组合物中的部分序列匹配。利用这3种接头，结合通用扩增反应液以及对应的PCR反应程序，可以对引物组合物扩增肿瘤患者样本得到的产物分别加上对应平台的接头，达成一种试剂同时适用于三种主流NGS测序平台的效果。作为本专利技术的进一步改进，所述试剂适用于新鲜或冰冻组织、FFPE、及外周血ctDNA的分子检测。本专利技术进一步保护一种上述的试剂在基于NGS方法的肺癌或结直肠癌相关基因检测中的应用。本专利技术具有如下有益效果：1.本专利技术所述的引物组合物的设计，是根据NCCN指南、FDA/NMPA指南，结合多个权威数据库，精选22个肺癌或结直肠癌相关基因的突变热点区域，满足肺癌早筛、诊断、用药、预后的一般需要本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，其特征在于，包括103对引物或包含其中部分引物的组合，每对引物的正向引物与反向引物序列均包括扩增引物对，以及与所述扩增引物对5’端连接的其他序列；每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列选自SEQ ID NO.1～206所示的序列。/n

【技术特征摘要】
20200622 CN 20201057600201.一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，其特征在于，包括103对引物或包含其中部分引物的组合，每对引物的正向引物与反向引物序列均包括扩增引物对，以及与所述扩增引物对5’端连接的其他序列；每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列选自SEQIDNO.1～206所示的序列。


2.根据权利要求1所述一种肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，其特征在于，每对所述引物的正向引物与反向引物中的特异性序列为所述序列其中的18-25个碱基序列。


3.如权利要求1所述的肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，其特征在于，所述扩增引物对的正向引物包括SEQIDNO.207所示的序列，优选地，为所述序列其中的16-25个碱基序列。


4.如权利要求1所述的肺癌或结直肠癌突变基因检测引物组合物，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋钢，王朝晖，
申请(专利权)人：上海真固生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31