本发明专利技术涉及一种检测BRAF基因突变的核酸组合物及试剂盒和BRAF基因突变的检测方法。该检测BRAF基因突变的核酸组合物，包括：序列如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示的第一引物对和序列如SEQ ID No.3所示的第一探针，第一引物对和第一探针用于检测BRAF基因的V600E突变。上述核酸组合物中第一引物对及第一探针对BRAF基因的V600E突变的特异性较高，能够检测BRAF基因的V600E突变，且检测灵敏度较高。
【技术实现步骤摘要】
检测BRAF基因突变的核酸组合物及试剂盒和BRAF基因突变的检测方法
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种检测BRAF基因突变的核酸组合物及试剂盒和BRAF基因突变的检测方法。
技术介绍
BRAF基因编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是MEK-ERK信号通路中的重要转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。BRAF发生突变会影响细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。BRAF的突变形式中主要为V600E突变(即BRAF基因第15号外显子上第600位的氨基酸由缬氨酸突变为谷氨酸)。因此，测定BRAF基因的V600E突变意义非凡。目前，BRAF基因V600E突变检测的方法主要有以下几种：(1)Sanger测序法；直接测序法一直以来是基因突变检测的金标准，但是测序法的灵敏度低，特别是在混合模板时检出率低，一般需要突变丰度达到20％以上才能准确检测。(2)高分辨率熔解曲线(high-resolutionmelting，HRM)是通过饱和染料结合于PCR扩增产物监控其形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，但其灵敏度为5％左右。这些方法的检测灵敏度较低，不能满足实际需求。
技术实现思路
基于此，有必提供一种灵敏度较高的检测BRAF基因突变的核酸组合物。此外，还有必要提供一种检测BRAF基因突变的试剂盒和BRAF基因突变的检测方法。一种检测BRAF基因突变的核酸组合物，包括：序列如SEQIDNo.1及SEQIDNo.2所示的第一引物对和序列如SEQIDNo.3所示的第一探针，所述第一引物对和所述第一探针用于检测BRAF基因的V600E突变。本研究经过大量试验，意料不到地发现，上述核酸组合物中第一引物对及第一探针对BRAF基因的V600E突变的特异性较高，能够检测BRAF基因的V600E突变，且检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的BRAF基因的V600E突变，灵敏度较高。其中一个实施例中，还包括：用于检测内控基因的第二引物对和第二探针。其中一个实施例中，所述内控基因为CFTR基因，所述第二引物对的序列如SEQIDNo.4及SEQIDNo.5所示，所述第二探针的序列如SEQIDNo.6所示。其中一个实施例中，所述第一探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第二荧光报告基团与所述第一荧光报告基团不同。其中一个实施例中，所述第一荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种，所述第二荧光报告基团选自CY5及FAM中的另一种。其中一个实施例中，还包括质控引物对和质控探针。其中一个实施例中，所述质控引物对的序列如SEQIDNo.7及SEQIDNo.8所示，所述质控探针的序列如SEQIDNo.9所示。一种检测BRAF基因突变的试剂盒，包括上述检测BRAF基因突变的核酸组合物。其中一个实施例中，还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。一种BRAF基因突变的检测方法，包括如下步骤：向待测样品中加入检测BRAF基因突变的核酸组合物进行PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析；其中，所述检测BRAF基因突变的核酸组合物包括：序列如SEQIDNo.1及SEQIDNo.2所示的第一引物对和序列如SEQIDNo.3所示的第一探针，所述第一引物对和所述第一探针用于检测BRAF基因的V600E突变。其中一个实施例中，所述第一探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述根据反应结果进行检测分析的步骤包括：若所述第一荧光报告基团所在通道出现熔解峰，且所述第一荧光报告基团所在通道的Tm值为58±1℃，则所述待测样本的BRAF基因发生V600E突变。其中一个实施例中，所述检测BRAF基因突变的核酸组合物包括：用于检测内控基因的第二引物对和第二探针，所述内控基因为CFTR基因，所述第二引物对的序列如SEQIDNo.4及SEQIDNo.5所示，所述第二探针的序列如SEQIDNo.6所示，所述第二探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第二荧光报告基团与所述第一荧光报告基团不同，所述根据反应结果进行检测分析的步骤包括：若所述第一荧光报告基团所在通道与所述第二荧光报告基团所在通道均出现熔解峰，并所述第一荧光报告基团所在通道的Tm值为58±1℃，且所述第二荧光报告基团所在通道的Tm值为62±2℃，则所述待测样本的BRAF基因发生V600E突变。其中一个实施例中，如SEQIDNo.1所示的序列为第一正向引物，如SEQIDNo.2所示的序列为第一方向引物，如SEQIDNo.4所示的序列为第二正向引物，如SEQIDNo.5所示的序列为第二方向引物，突变检测反应体系包括：2mM～5mM的MgCl2，20mM～50mM的、pH8.3的Tris，200mM～500mg/L的BSA，50μM～100μM的dNTPs，0.2U-1U的酶Ⅰ混合液，0.1μM～0.5μM的所述第一正向引物，0.1μM～0.5μM的所述第一反向引物，0.1μM～0.5μM的所述第一探针，0.1μM～0.5μM的所述第二正向引物，0.1μM～0.5μM的所述第二反向引物，0.1μM～0.5μM的所述第二探针。其中一个实施例中，所述检测BRAF基因突变的核酸组合物还包括：质控引物对和质控探针，所述质控引物对包括质控正向引物和质控反向引物，检测野生型BRAF基因的质控检测反应体系包括：2mM～5mM的MgCl2、20mM～50mM的Tris、10mM～50mM的KCl、200mg/mL～500mg/mL的BSA、50μM～100μM的dNTPs、0.5U～2U的酶Ⅱ混合液、0.1μM～0.5μM的所述质控正向引物，0.1μM～0.5μM的所述质控反向引物、0.1μM～0.5μM的所述质控探针。附图说明图1为实施例2中人BRAF基因V600E突变位点检测限测试图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施的限制。本研究一实施方式提供一种检测BRAF基因突变的核酸组合物，能够检测BRAF基因的V600E突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测BRAF基因突变的核酸组合物，包括：序列如SEQIDNo.1及SEQIDNo.2所示的第一引物对和序列如SEQIDNo.3所示的第一探针，第一引物对和第一探针用于检测BRAF基因的V600E突变。具体地，如SEQIDNo.1所示的序列为：GTGATTTTGGTCTAGCTAC。如SEQIDNo.2所示的序列为：TCAGTGGAAAAATAGCCTCAATTC本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测BRAF基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：序列如SEQ ID No.1及SEQID No.2所示的第一引物对和序列如SEQ ID No.3所示的第一探针，所述第一引物对和所述第一探针用于检测BRAF基因的V600E突变。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测BRAF基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：序列如SEQIDNo.1及SEQIDNo.2所示的第一引物对和序列如SEQIDNo.3所示的第一探针，所述第一引物对和所述第一探针用于检测BRAF基因的V600E突变。
2.根据权利要求1所述的检测BRAF基因突变的核酸组合物，其特征在于，还包括：用于检测内控基因的第二引物对和第二探针。
3.根据权利要求2所述的检测BRAF基因突变的核酸组合物，其特征在于，所述内控基因为CFTR基因，所述第二引物对的序列如SEQIDNo.4及SEQIDNo.5所示，所述第二探针的序列如SEQIDNo.6所示。
4.根据权利要求2～3任一项所述的检测BRAF基因突变的核酸组合物，其特征在于，所述第一探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第二探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第二荧光报告基团与所述第一荧光报告基团不同。
5.根据权利要求4所述的检测BRAF基因突变的核酸组合物，其特征在于，所述第一荧光报告基团选自CY5及FAM中的一种，所述第二荧光报告基团选自CY5及FAM中的另一种。
6.根据权利要求1～3及5任一项所述的检测BRAF基因突变的核酸组合物，其特征在于，还包括质控引物对和质控探针。
7.根据权利要求6所述的检测BRAF基因突变的核酸组合物，其特征在于，所述质控引物对的序列如SEQIDNo.7及SEQIDNo.8所示，所述质控探针的序列如SEQIDNo.9所示。
8.一种检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的检测BRAF基因突变的核酸组合物。
9.根据权利要求8所述的检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
10.一种BRAF基因突变的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
向待测样品中加入检测BRAF基因突变的核酸组合物进行PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析；其中，所述检测BRAF基因突变的核酸组合物包括：序列如SEQIDNo.1及SEQIDNo.2所示的第一引物对和序列如SEQIDNo.3所示的第一探针，所述第一引物对和所述第一探针用于检测BRAF基因的V600E突变。
11.根据权利要求10所述的BRAF基因突变的检测方法，其特征在于，所述第一...
【专利技术属性】
技术研发人员：张炳为，辜嘉，周树民，
申请(专利权)人：苏州中科先进技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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