一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞技术方案

本发明专利技术公开了一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞，编码硒蛋白的基因在3'端非翻译区UTR的Sec插入序列SECIS；制备pME‑Hyg‑sHF‑特定蛋白‑Sec‑GPI‑SECIS；扩增人SELT基因的SECIS序列，并将特定蛋白基因序列与密码子TGA和人源CD59蛋白的GPI修饰序列及终止密码子TAA插入到NotI位点之后，即构建了含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统。该系统可以将可溶性重组蛋白表达到细胞膜表面，避免蛋白分泌到培养基，通过检测细胞膜表面蛋白的量分析重组蛋白的表达量，大大简化了检测和筛选高表达细胞的难度。与其它筛选系统相比，该系统将重组可溶蛋白表达在细胞膜表面，利用流式分选，筛选方便，高效。

【技术实现步骤摘要】
一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞
本专利技术属于
，具体涉及一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统及高表达重组蛋白的细胞。
技术介绍
利用哺乳动物细胞生产重组蛋白受到了越来越多的关注，因为它们越来越多地被用于生物制药和临床研究。哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，幼仓鼠肾细胞，小鼠骨髓瘤细胞和人胚肾293(HEK293)细胞，由于其合适的蛋白折叠、组装和翻译后修饰能力，已被广泛用于重组蛋白的生产。近年来药物蛋白的需求量逐年增加，目前提高生产率主要通过提高基因转染效率和基因扩增率，宿主细胞工程，培养基优化及工艺工程和开发。但是，高产细胞株的筛选和选择仍然基于基因整合，其次是药物选择或荧光激活细胞分选(FACS)。此外，大多数重组药物蛋白是分泌蛋白，难以从大量细胞中选择高产细胞系。因此，大规模生产仍然是耗时耗力的工作。通过选择系统的进一步改进，仍然存在提高生产率的机会。哺乳动物细胞中，大多数膜蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固定在细胞表面。GPI锚定蛋白(GPI-APs)在内质网中合成。具有GPI信号的蛋白质被识别，切割，然后GPI通过由PIGK，GPAA1，PIGS，PIGT和PIGU组成的GPI转酰胺酶复合物转移到新生蛋白质C末端。PIGK是GPI转酰胺酶的催化亚基。破坏PIGK会导致GPI-AP表面表达缺失。当将GPI附着信号添加到分泌蛋白的C末端时，这些蛋白就表示为GPI-AP。因此，有可能通过GPI锚定在细胞表面表达广泛的分泌型重组蛋白。硒是具有重要生物医学潜力的必需微量元素，被掺入硒蛋白中存在的氨基酸硒代半胱氨酸。硒蛋白在各种器官中被广泛认为是抗氧化剂。硒缺乏会引起多种疾病，包括不育，发育迟缓和免疫力低下。编码硒蛋白的基因在3'端非翻译区(UTR)中包含Sec插入序列(SECIS)，这对于识别框内密码子UGA(通常是终止密码子)作为掺入Sec残基的信号是必不可少的。SECIS元素和框架内UGA密码子的组合已用于鉴定多种生物中的硒蛋白质组。硒对于阻止SARS病毒病毒突变有独特作用。此外，病毒可使人体产生大量自由基，造成一系列连锁反应，而硒的强大清除自由基作用可破坏这一循环，从而保护脏器不受侵害。美国西弗吉尼亚大学医学院的研究者们建议每天服用200微克硒，以提高人体免疫力，对抗“非典”。此外，缺硒人群食欲较差，也是导致其缺硒和抗病能力下降的原因之一。研究还发现，适量补硒可有效减轻焦虑、抑郁和疲倦，利于机体康复。美国国家科学院食物营养协会推荐10岁以上儿童及成人每人每日硒的摄入量宜在50-200微克。目前临床推荐的安全使用剂量为5ug/kg·d体重(治疗量)。一般认为，成人对硒的正常生理需要量为60-400ug/d。长期过量服用硒可导致脱发、指甲和皮肤变暗等。我国从东北到西南存在着一条缺硒地带，这些低硒地区人群每日硒摄入量不足10ug，从而导致多种疾病发生。如江苏省启东县为贫硒地区，当地居民血硒水平仅(0.076±0.0237)ug/ml，导致肝炎及肝癌高发。目前，许多国家正积极开发有机硒。与无机硒相比，硒蛋白具有生物利用度高、生理活性强、毒性低等特点。
技术实现思路
本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。鉴于上述的技术缺陷，提出了本专利技术。因此，作为本专利技术其中一个方面，本专利技术克服现有技术中存在的不足，提供一种利用含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统筛选高表达重组蛋白的细胞。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其包括，编码硒蛋白的基因在3'端非翻译区UTR的Sec插入序列SECIS，能识别开放阅读框内终止密码子TGA并翻译成硒代半胱氨酸；制备pME-Hyg-sHF-特定蛋白-Sec-GPI-SECIS；扩增人SELT基因的SECIS序列，并将特定蛋白基因序列与密码子TGA和人源CD59蛋白的GPI修饰序列及终止密码子TAA插入到NotI位点之后，即构建了含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统。作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法的优选方案，其中：所述特定蛋白包括重组溶酶体酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶A中的一种或几种。作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法的优选方案，其中：所述sHF表示为内质网信号序列加上带有His6-FLAG-标签。作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法的优选方案，其中：还包括，将所述质粒转染到HEK293细胞中，并敲除PIGK基因。作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法的优选方案，其中：所述敲除PIGK基因，其包括，使用CRISPR/Cas9系统将HEK293细胞中的PIGK基因敲除；制备pX330-EGFP-PIGK-KO，转染后，获得PIGK-KO细胞；将pPB-FRT-PGKp-PurodTK插入到PIGK-KO细胞的基因组中；制备pPB-FRT-PurodTK-PIGK；将pPB-FRT-PurodTK-PIGK与pCMV-hyPBase共转染到PIGK-KO细胞中，用嘌呤霉素进行培养；加入pCMV-hyPBase和/或pCAG-FLBase-IRES-puroDNA，再用含MFIAU的培养基培养即可。作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法的优选方案，其中：所述带有PIGK-KO细胞不具有WT等位基因。作为本专利技术的另一方面，本专利技术提供一种含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的诱导方法，其包括：加入硒元素诱导转染后的HEK293细胞的细胞膜表面GPI形式的蛋白表达，所述硒元素来源于亚硒酸钠。作为本专利技术所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的诱导方法的优选方案，其中：所述亚硒酸钠的浓度为1～3μM，对应的所述转染后的HEK293细胞的密度为1×105。作为本专利技术的另一方面，本专利技术提供用于制备含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的引物，其包括：所述引物包括序列SEQNO.1～SEQNO.4中的一种或几种。作为本专利技术的另一方面，本专利技术提供用于制备含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的载体，其包括：所述载体包括特定蛋白-GPI、pME-Puro-sHF-特定蛋白-GPI、pME-Puro-sHF-特定蛋白-TGA-GPI、sHF-特定蛋白-GPI、sHF-特定蛋白-Sec、sHF-特定蛋白-Sec-GPI、sHF-特定蛋白-Cys-GPI、sHF-特定蛋白-Sec-GPI-SECIS、pME-Hyg-sHF-特定蛋白-GPI、pME-Hyg-sHF-特定蛋白-Sec-GPI-SECIS、pME-Hyg-sHF-特定蛋白-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：包括，/n编码硒蛋白的基因在3'端非翻译区UTR的Sec插入序列SECIS，能识别开放阅读框内终止密码子TGA并翻译成硒代半胱氨酸；/n制备pME-Hyg-sHF-特定蛋白-Sec-GPI-SECIS；/n扩增人SELT基因的SECIS序列，并将特定蛋白基因序列与密码子TGA和人源CD59蛋白的GPI修饰序列及终止密码子TAA插入到NotI位点之后，即构建了含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统。/n

【技术特征摘要】
1.一种含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：包括，
编码硒蛋白的基因在3'端非翻译区UTR的Sec插入序列SECIS，能识别开放阅读框内终止密码子TGA并翻译成硒代半胱氨酸；
制备pME-Hyg-sHF-特定蛋白-Sec-GPI-SECIS；
扩增人SELT基因的SECIS序列，并将特定蛋白基因序列与密码子TGA和人源CD59蛋白的GPI修饰序列及终止密码子TAA插入到NotI位点之后，即构建了含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统。


2.如权利要求1所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：所述特定蛋白包括重组溶酶体酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶A中的一种或几种。


3.如权利要求1所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：所述sHF表示为内质网信号序列加上带有His6-FLAG-标签。


4.如权利要求1～3任一所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：还包括，将所述质粒转染到HEK293细胞中，并敲除PIGK基因。


5.如权利要求4所述的含有硒代半胱氨酸的GPI锚定蛋白表达系统的制备方法，其特征在于：所述敲除PIGK基因，其包括，
使用CRISPR/Cas9系统将HEK293细胞中PIGK基因敲除；
制备pX330-EGFP-PIGK-KO，转染后，获得PIGK-KO细胞；
将pPB-FRT-PGKp-PurodTK插入到PIGK-KO细胞的基因组中；
制备pPB-FRT-PurodTK-PIGK；
将pPB-FRT-PurodTK-PIGK与pCMV-hyPBase共转染到PIGK-KO细胞中，用嘌呤霉素进行培养；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：藤田盛久，柳艺石，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32