选择真核宿主细胞的选择载体和方法技术

本发明专利技术涉及选择真核宿主细胞的选择载体和方法。具体涉及表达载体或至少2个表达载体的组合，所述载体包括：a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，其中所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少；b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，其中当向宿主细胞引入所述表达载体或至少2个表达载体的组合时，自所述宿主细胞分泌目标多肽。还提供合适的宿主细胞、选择方法和高产率生成多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
选择真核宿主细胞的选择载体和方法
本专利技术涉及新型选择系统，其基于突变叶酸受体作为选择性标记物以选择表达目标多肽的宿主细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞的应用。本专利技术提供适当表达载体、宿主细胞和方法，以选择高产率表达目标重组多肽的宿主细胞。此外，本专利技术涉及高产率有效生成重组多肽的方法。
技术介绍
大量克隆和表达目标产物如重组肽和蛋白的能力日益重要。纯化高水平蛋白的能力在人用药物和生物
重要，例如用于生成蛋白药物以及基础研究中，例如用于结晶蛋白从而能测定其三维结构。通过其他方式难以大量获得的蛋白能在宿主细胞中过表达，随后被分离并纯化。选择生成重组蛋白的表达系统取决于多种因素，包括目标蛋白的细胞生长特性、表达水平、胞内和胞外表达、翻译后修饰和生物活性，以及治疗蛋白生产中的法规问题和经济考量。哺乳动物细胞相比其它表达系统如细菌或酵母的关键优势是完成合适蛋白折叠、复杂N-连接糖基化和真O-连接糖基化以及广泛的其它翻译后修饰的能力。由于所述优势，真核且尤其是哺乳动物细胞是当前选择的用于生成复杂治疗蛋白如单克隆抗体的表达系统。获得高表达宿主细胞(也称为高生产者)的最常用方法产生用于表达目标多肽的合适表达载体作为第一步。表达载体驱动编码目标多肽的多核苷酸在宿主细胞内的表达并提供至少一个选择性标记物用于产生重组细胞系。一种已建立的获得高产率表达目标多肽的高生产细胞系的方法是稳定转染宿主细胞。然后，目标多肽分泌到培养基中且能从中大量获得。然而，稳定整合到基因组中是稀有事件，仅一小部分稳定转染细胞是高生产者。为了获得高产率表达目标多肽的宿主细胞，广泛使用选择性标记物和选择系统。各系统还用于产生和鉴定稳定转染的克隆。用各选择性标记物和选择系统的主要目标是引入选择基因，其在暴露于选择性生长条件后能够鉴定能高水平生成目标重组产物的细胞。例如，已建立的选择性标记物包括二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰氨合成酶(GS)。另一选择系统基于还原叶酸载体选择系统。还原叶酸载体(RFC)是无所不在地表达的膜糖蛋白，担当摄入还原叶酸如5-甲基-THF和5-甲酰基-THF的主要转运子。然而，RFC展现出对氧化叶酸、叶酸的极弱亲和性。因此，缺乏RFC表达或缺失基因组RFC基因座的细胞能充当一定条件下转染选择性标记物基因RFC的受体，所述条件中生长培养基中的还原叶酸如5-甲酰基-THF逐步除去，从而迫使细胞表达更高水平的该叶酸转运子。RFC选择系统有几个缺陷：a)必须使用RFC无效受体细胞，其中内源RFC基因座被敲除或通过靶向敲除或失功能突变而失活。b)RFC对叶酸有极弱的转运亲和性且因此所述氧化叶酸不能用于选择。c)与作为单向叶酸摄取系统的叶酸受体基系统(见下)相反，RFC是双向叶酸转运子，其显示同样有效的叶酸输入和输出。这意味着在叶酸缺失情况下，RFC过表达可能对受体细胞有害，所述细胞通过过表达的RFC进一步输出叶酸。另一近期提出的选择系统是基于叶酸受体如叶酸受体α作为选择性标记物的应用。WO2009/080759描述了该系统。此系统的数种优势在于，就选择而言，不需要毒性物质而且宿主细胞的内源叶酸受体无需敲除。WO2010/097240描述了另一基于叶酸受体用作选择性标记物的选择系统。叶酸受体和其突变体参见例如Shen等“决定叶酸受体α和β不同配体特异性的氨基酸残基的鉴定”(Identificationofaminoacidresiduesthatdeterminethedifferentialligandspecificitiesoffolatereceptorsalphaandbeta)(Biochemistry1997,36,6157-6163)。还描述了与医学疾病相关的叶酸受体α突变。叶酸受体中氨基酸位置还在Ramamoorthy等“计算机模拟分析叶酸受体中的功能性重要残基”(Insilicoanalysisoffunctionallyimportantresiduesinfolatereceptors)(Bioinformation2(4):157-162(2007))中分析。高严格性的选择系统对选择以及因此从转染群中富集高生产细胞是至关重要的。选择系统的严格性越高，选择过程后的低生产者数量越少，且发现极罕见高产克隆的机会越高。此外，非常需要提供比现有技术方法能更迅速获得高产克隆的选择系统。本专利技术的目的是提供严格选择系统以选择高产率生成目标多肽的宿主细胞，以及合适的表达载体和宿主细胞。特别地，本专利技术的目的是提供相比上述现有技术中的选择系统具有某些优势的新型选择系统。
技术实现思路
本专利技术涉及适合选择高产率表达目标多肽的宿主细胞的选择系统。所述选择系统基于突变功能膜结合叶酸受体作为选择性标记物的应用。此外，所述选择系统相比使用相应的野生型功能膜结合叶酸受体作为选择性标记物的选择系统，能更严格和快速地选择高生产者。根据第一方面，本专利技术提供表达载体或至少2个表达载体的组合，所述载体包括：a)编码作为选择性标记物的突变叶酸受体的多核苷酸，其中所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少和b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，其中当向宿主细胞引入所述表达载体或至少2个表达载体的组合时，所述宿主细胞分泌目标多肽。根据第二方面，本专利技术涉及活力取决于叶酸摄取的宿主细胞，包括a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的引入多核苷酸，所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，和b)至少一种编码目标多肽的引入多核苷酸其中所述宿主细胞分泌所述目标多肽。根据第三方面，本专利技术涉及生成本专利技术第二方面所述宿主细胞的方法，包括向活力取决于叶酸摄取的宿主细胞引入至少以下物质的步骤a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，和b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，其中所述宿主细胞分泌目标多肽。根据第四方面，本专利技术提供选择至少一种能表达目标多肽的宿主细胞的方法，包括a)提供多种第二方面所述的宿主细胞；b)在含极限浓度叶酸盐的选择性培养基中培养所述多种宿主细胞；和c)获得至少一种表达目标多肽的宿主细胞。根据第五方面，本专利技术涉及生成目标多肽的方法，包括a)在容许目标多肽表达和分泌的条件下，培养本专利技术第二方面所述宿主细胞和/或根据第四方面选定的宿主细胞；b)从细胞培养基中分离目标多肽和c)任选进一步加工分离的目标多肽。根据第六方面，本专利技术涉及多核苷酸用于选择其活力取决于叶酸摄取的细胞的应用，所述多核苷酸编码以下作为选择性标记物：a)包括以下序列的突变叶酸受体其中Xaa不是丙氨酸且其中突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较其中Xaa是丙氨酸的对应野生型叶酸受体(SEQIDNO1)减少，或b)突变叶酸受体，其所含氨基酸序列与SEQIDNO9所示序列有至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达载体或至少2个表达载体的组合，所述载体包括：/na)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，其中所述突变叶酸受体是功能性膜结合叶酸受体，且所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，所编码的突变叶酸受体衍生自哺乳动物的突变叶酸受体α且在结构上对应于或通过氨基酸序列同源性对应于SEQ ID NO:1所示成熟野生型人叶酸受体α序列的第49位氨基酸处包含氨基酸取代，其中存在于该野生型序列中的丙氨酸被氨基酸取代导致叶酸结合亲和力降低；/nb)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，/n其中当向宿主细胞引入所述表达载体或至少2个表达载体的组合时，自所述宿主细胞分泌目标多肽。/n

【技术特征摘要】
20130731 US 61/860,4391.一种表达载体或至少2个表达载体的组合，所述载体包括：
a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，其中所述突变叶酸受体是功能性膜结合叶酸受体，且所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，所编码的突变叶酸受体衍生自哺乳动物的突变叶酸受体α且在结构上对应于或通过氨基酸序列同源性对应于SEQIDNO:1所示成熟野生型人叶酸受体α序列的第49位氨基酸处包含氨基酸取代，其中存在于该野生型序列中的丙氨酸被氨基酸取代导致叶酸结合亲和力降低；
b)至少一种编码目标多肽的多核苷酸，
其中当向宿主细胞引入所述表达载体或至少2个表达载体的组合时，自所述宿主细胞分泌目标多肽。


2.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，存在于所述野生型序列第49位处的丙氨酸被选自下组的氨基酸取代：亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸。


3.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，存在于所述野生型序列第49位处的丙氨酸被亮氨酸取代。


4.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，所编码的突变叶酸受体：
a)是衍生自人的是突变叶酸受体α；或
b)是衍生自人的是突变叶酸受体α，其中在结构上对应于或通过氨基酸序列同源性对应于SEQIDNO:1所示成熟野生型人叶酸受体α的第49位氨基酸处的丙氨酸被选自下组的氨基酸取代：亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸。


5.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，所编码的突变叶酸受体具有以下特征：
成熟的突变叶酸受体包括以下序列：



其中Xaa是选自下组的氨基酸：亮氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、组氨酸和天冬氨酸，或为亮氨酸。


6.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，所编码的突变叶酸受体包括以下序列：



其中Xaa是亮氨酸。


7.如权利要求1-6中任一项所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其额外包括编码参与叶酸代谢的选择性标记物的多核苷酸。


8.如权利要求7所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，所述编码选择性标记物的多核苷酸编码二氢叶酸还原酶。


9.如权利要求7所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其包括：
a)含编码突变叶酸受体的多核苷酸的表达盒，其中所编码的突变叶酸受体包括在结构上对应于或通过氨基酸序列同源性对应于SEQIDNO:1所示成熟野生型人叶酸受体α序列第49位氨基酸的位置处的丙氨酸被亮氨酸取代；
b)至少一个含编码目标多肽的多核苷酸的表达盒；和
c)含编码二氢叶酸还原酶作为选择性标记物的多核苷酸的表达盒。


10.如权利要求1-6中任一项所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其中所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体，对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低；和/或，所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体对叶酸的结合亲和力降低。


11.如权利要求7所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其中所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体，对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低；和/或，所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体对叶酸的结合亲和力降低。


12.活力取决于叶酸摄取的宿主细胞，包括
a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的引入多核苷酸，所述突变叶酸受体是功能性膜结合叶酸受体，且所述突变叶酸受体的叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少，所编码的突变叶酸受体衍生自哺乳动物的突变叶酸受体α且在结构上对应于或通过氨基酸序列相同性对应于SEQIDNO:1所示成熟野生型人叶酸受体α的第49位氨基酸处包含氨基酸取代，其中存在于该野生型序列中的丙氨酸被氨基酸取代从而导致叶酸结合亲和力降低；
和
b)至少一种编码目标多肽的引入多核苷酸
其中所述目标多肽分泌自活力取决于叶酸盐摄入的所述宿主细胞，且其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。


13.如权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，所述突变叶酸受体具有一种或多种如权利要求2-6和10中任一项所定义的特征。


14.如权利要求13所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞包括如权利要求1-11...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·G·阿萨拉夫，T·约斯托克，HP·诺夫，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH