一种用于软骨组织的消化液及其方法技术

本发明专利技术公开一种用于软骨组织的消化液，所述消化液包括以下可成份：II型胶原酶1‑3mg/ml；IV型胶原酶1‑3mg/ml；中性蛋白酶5ml；DNA酶12units/ml；FBS(V/V)10％；CaCl2 0.053mg/L。本发明专利技术有益效果在于可获得的细胞获取率高且细胞具有较高的活性，且成团率低，对细胞损伤较小，转录组变化低，可以后续进行培养或者单细胞转录组测序。

【技术实现步骤摘要】
一种用于软骨组织的消化液及其方法
本专利技术属于生物医疗领域，具体涉及一种用于软骨组织的消化液及其消化的方法。
技术介绍
软骨组织由软骨细胞、纤维和基质构成。在胚胎发生时期，软骨作为临时性骨骼，成为身体支架，随着胎儿的发育，软骨逐渐被骨所代替，在成人体内仍保留一些软骨组织，具有支持和保护功能。近年来,许多研究表明软骨细胞反分化是关节软骨损伤病理以及修复的重要现象，许多研究方法都需要软骨组织消化为单一细胞进行研究，如软骨组织工程研究，软骨细胞分化研究等等，因此软骨细胞的培养方法成为重要的步骤之一。目前软骨细胞消化的过程中，存在的问题主要有：组织块消化不彻底，消化时间长，酶浓度过高等导致细胞死亡，导致后续的实验出现一系列的问题。针对软骨组织材料的不足，从有限的软骨组织中图区足够量及活性高得软骨细胞成为后续软骨细胞培养的关键。目前软骨细胞分离方法将为常见的是通过II型胶原酶消化法来进行获取，但是该方法存在较多的缺点，主要包括：1、II型胶原酶虽然属于温和的消化酶，但是依然对细胞有损伤，特别是再消化过度时，对细胞的损伤十分明显。2、II型胶原酶在使用过程中极易出现活性丧失，降低消化作用，严重的将导致无法实现对软骨细胞的消化分离。3、使用II型胶原酶消化后软骨细胞容易消化不完全，极易形成2个细胞成团现象，对于某一些后续实验例如单细胞转录组测序，有成团的细胞将会导致后续实验失败。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于软骨组织的消化液及其消化的方法，通过本专利技术的消化液进行消化后可以显著提高软骨细胞原代培养的效率，并显著的降低双细胞的细胞成团率。具体的说，本专利技术通过改变消化的酶种类和消化酶浓度，提高原代细胞的细胞活率和降低细胞成团率。目前单细胞转录组测序对组织处理后的细胞悬液细胞成团率有要求，较高的成团率，会影响单细胞转录组测序的结果。本方法为研究骨关节炎的发病机制和筛选相关药物奠定了实验基础，提高了科研效率。为了实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种用于软骨组织的消化液，所述消化液包括以下可成份：II型胶原酶1-3mg/ml；IV型胶原酶1-3mg/ml；中性蛋白酶5ml；DNA酶12units/ml；FBS(V/V)10％；CaCl20.053mg/L。优选的，所述II型胶原酶为2mg/ml，所述IV型胶原酶为2mg/ml。本专利技术还提供一种制备用于软骨组织的消化液的方法，具体的说，于离心管中分别加入中性蛋白酶5ml，II型胶原酶2mg/ml、IV型胶原酶2mg/ml、DNA酶12units、CaCl20.053mg/L、FBS(V/V)10％，混合均匀即获得消化液。本专利技术还提供一种使用软骨组织的消化液进行消化的方法，所述方法包括以下步骤：S1：预处理：获得软骨组织；S2：将组织置于平皿中，移液器滴加2-3滴所述消化液防止干燥；S3：将组织切碎，添加到所述消化溶液进行消化，置于37度摇床1.5-3h；S4：隔30min用移液器混匀；S5：消化完全后，取出后用40um筛网过滤2次，离心。S6：加入5ml的DPBS重悬细胞团，充分吹散后300g离心。S7：缓慢吸取3.5ml上清并丢弃，用常规口径枪头充分混匀下层细胞沉淀，得到的细胞即为活性较高的单个细胞悬液。S5中过滤网方法为，先用70um滤网过滤，再用40um滤网进行2次过滤，离心速度为400g，时间为4min。本专利技术有益效果在于可获得的细胞获取率高且细胞具有较高的活性，且成团率低，对细胞损伤较小，转录组变化低，可以后续进行培养或者单细胞转录组测序。附图说明图1为本专利技术的软骨消化死活细胞荧光图；图2为本专利技术的软骨消化细胞白光图；图3为使用现有消化酶对软骨细胞进行消化的死活细胞荧光图。具体实施方式以下将对本专利技术作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围并不限于本实施例。本专利技术为一种用于软骨组织的消化液，所述消化液包括以下可成份：II型胶原酶1-3mg/ml；IV型胶原酶1-3mg/ml；中性蛋白酶5ml；DNA酶12units/ml；FBS(V/V)10％；CaCl20.053mg/L。优选的，所述II型胶原酶为2mg/ml，所述IV型胶原酶为2mg/ml。本专利技术还提供一种制备用于软骨组织的消化液的方法，具体的说，于离心管中分别加入中性蛋白酶5ml，II型胶原酶2mg/ml、IV型胶原酶2mg/ml、DNA酶12units、CaCl20.053mg/L、FBS(V/V)10％，混合均匀即获得消化液。本专利技术还提供一种使用软骨组织的消化液进行消化的方法，所述方法包括以下步骤：S1：预处理：获得软骨组织；S2：将组织置于平皿中，移液器滴加2-3滴所述消化液防止干燥；S3：将组织切碎，添加到所述消化溶液进行消化，置于37度摇床1.5-3h；S4：隔30min用移液器混匀；S5：消化完全后，取出后用40um筛网过滤2次，离心。S6：加入5ml的DPBS重悬细胞团，充分吹散后300g离心。S7：缓慢吸取3.5ml上清并丢弃，用常规口径枪头充分混匀下层细胞沉淀，得到的细胞即为活性较高的单个细胞悬液。S5中过滤网方法为，先用70um滤网过滤，再用40um滤网进行2次过滤，离心速度为400g，时间为4min。实施例在离心管中分别加入中性蛋白酶5ml，II型胶原酶2mg/ml、IV型胶原酶2mg/ml、DNA酶12units、CaCl20.053mg/L、FBS(V/V)10％，混合均匀即获得消化液。通过下表进一步陈述本专利技术的有益效果，将常规消化方法消化软骨组织后细胞悬液和本专利技术的消化液消化的细胞悬液结果对比，如下表所示。更进一步的说，如图3所示，为使用现有的消化酶对软骨进行消化后死活细胞荧光图，从图中明显看出软骨细胞容易消化不完全，极易形成细胞成团现象；进一步的，如图1、图2所示，通过本专利技术的消化液进行消化后，可以明显看出使用本专利技术的消化液进行消化后，获得的细胞获取率高且细胞具有较高的活性，且成团率低。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本专利技术权利要求的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于软骨组织的消化液，其特征在于，所述消化液包括以下可成份：/nII型胶原酶1-3mg/ml；/nIV型胶原酶1-3mg/ml；/n中性蛋白酶5ml；/nDNA酶12units/ml；/nFBS(V/V)10％；/nCaCl2 0.053mg/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于软骨组织的消化液，其特征在于，所述消化液包括以下可成份：
II型胶原酶1-3mg/ml；
IV型胶原酶1-3mg/ml；
中性蛋白酶5ml；
DNA酶12units/ml；
FBS(V/V)10％；
CaCl20.053mg/L。


2.根据权利要求1所述的用于软骨组织的消化液，其特征在于，所述II型胶原酶为2mg/ml，所述IV型胶原酶为2mg/ml。


3.一种制备如权利要求1或2所述的用于软骨组织的消化液的方法，其特征在于，于离心管中分别加入中性蛋白酶5ml，II型胶原酶2mg/ml、IV型胶原酶2mg/ml、DNA酶12units、CaCl20.053mg/L、FBS(V/V)10％，混合均匀即获得消化液。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：林传勇，吴声鹏，
申请(专利权)人：广州元信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44