一株重组枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株高产sublancin的重组枯草芽孢杆菌JY011802及其应用，所述重组枯草芽孢杆菌JY011802于2018年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.16667。所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产sublancin的产量可以达到3100mg/L。

【技术实现步骤摘要】
一株重组枯草芽孢杆菌及其应用
本专利技术属于微生物领域，具体地，本专利技术涉及一株重组枯草芽孢杆菌及其在生产sublancin中的应用。
技术介绍
过度使用抗生素导致的细菌耐药性问题日益突出，使临床抗感染治疗陷入困境。在养殖业，长期使用抗生素促生长剂情况更为严重，不但因抗生素大量残留间接给人类健康带来危害，而且还导致畜禽免疫力低下，增加传染性疾病的发生，加大了养殖成本。目前，细菌、病毒、寄生虫等引起的疾病仍是制约规模化养殖的重要因素，随着现代兽医学、免疫学及分子生物学的发展，已发现许多畜禽疾病的发生、发展与机体免疫功能低下密切相关，治疗方向已由直接杀灭或抑制病原菌调整为提高机体免疫力。免疫调节剂能促进机体的体液免疫及细胞免疫，安全性高，无药物残留。抗菌肽(Antimicrobialpeptides，AMPs)是生物进化上最古老的抗微生物感染多肽，是从原核生物到人等各种生物先天性免疫调节的重要组成部分，是具有直接抗菌和菌群调节作用的固有免疫效应分子。在历史上，最先认识到抗菌肽的抗菌功能，因此最先将其命名为抗菌肽。随着对该类物质结构和功能的逐步深入认识，近年来已经发现抗菌肽在调节机体免疫应答方面有着非常重要的作用，很多抗菌肽是先天性免疫和获得性免疫的桥梁。抗菌肽通过直接杀菌/抑菌作用和提高机体免疫应答水平而发挥其抗感染作用，这是抗菌肽优于抗菌素之处。因此，目前又将抗菌肽称为免疫防御肽。目前的研究表明，抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗原虫、调节机体免疫力等活性，并且不容易产生耐药性。抗菌肽具有多种免疫调节作用，包括调节炎症反应、趋化免疫细胞、促进细胞分化、激活先天性和获得性免疫系统等。抗菌肽的多种免疫调节特性使得其有望成为治疗感染疾病和免疫疾病的药物。采用基因工程手段改造的枯草芽孢杆菌经发酵、分离、纯化得到的Sublancin是抗菌肽的一种。药理学实验表明，Sublancin能够增强巨噬细胞的吞噬功能。临床试验表明，Sublancin能够增强家禽的机体免疫功能，提高疫苗的免疫效果，安全性高，无药物残留。国内外对Sublancin也有一些研究，1998年，PaikSH等对枯草芽孢杆菌168产生的新型羊毛硫抗生素Sublancin168的化学和生物学结构特征及转运蛋白基因的鉴定进行了研究，得出Sublancin是由37个氨基酸残基组成的多肽，含有两个二硫键，其水溶液在室温条件下存放两年，没有发生降解和失活，可见其比较稳定。虽然Sublancin具有很好的替代传统抗生素的潜力，但枯草芽孢杆菌产生Sublancin的产量很低，不能满足大规模使用的需求。所以，国内外学者一直致力于提高Sublancin产量的研究，ShengyueJi等通过引入三个特异性启动子，重组枯草芽孢杆菌的操纵子，来提高Sublancin的产量，最终使重组枯草芽孢杆菌产生Sublancin的产量提高到642mg/L发酵液。最近，我国西北农林大学的最新研究结果表明，通过化学计量学方法和统计试验设计，优化发酵参数，最终使枯草芽孢杆菌168合成Sublancin的产量提高到129.72mg/L发酵液。国内外学者对于Sublancin的结构已经有了比较系统的研究，PaikSH等采用反向HPLC法检测得出Sublancin的分子量为3877.78Da，利用N末端氨基酸序列分析法得出Sublancin168是一个由37个氨基酸残基组成的含有两个二硫键的羊毛硫抗生素。TrentJ.Oman等采用串联质谱法进一步研究得出Sublancin168不属于羊毛硫抗生素，而是一个在22位半胱氨酸残基连接一个葡萄糖的糖基化多肽，这个葡萄糖的分子量为162Da。近期由GarciaDeGonzaloCV等通过核磁共振法(NMR)解析得出了Sublancin的三级结构，结果说明Sublancin包含两个α螺旋、一个清晰的内螺旋环区和两个二硫键。这两个α螺旋分别包含了6-16和26-35位氨基酸残基，内螺旋环区则跨越了17-25位氨基酸残基，而这个有9个氨基酸残基组成的内螺旋环区又包含了一个连接在第22位半胱氨酸的β-S-糖基，疏水作用和氢键连接保证了该环区结构的稳定性，而这个三维结构则保证了Sublancin的超高稳定性。
技术实现思路
本专利技术人通过基因工程手段改造枯草芽孢杆菌，大大提高了Sublancin的产量。本专利技术的一个目的是提供一株高产sublancin的枯草芽孢杆菌。本专利技术的另一个目的是提供一种生产重组枯草芽孢杆菌的方法。本专利技术还一个目的是提供由上述生产重组枯草芽孢杆菌的方法得到的重组枯草芽孢杆菌。本专利技术的又一个目的是提供一种生产sublancin的方法。一方面，本专利技术提供一株重组枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JY011802，其于2018年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为：CGMCCNo.16667。另一方面，本专利技术提供一种生产重组枯草芽孢杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：1).将表达sublancin的目的基因片段连接到克隆载体(优选pJET1.2/Blunt)得到重组克隆载体，再将所述重组克隆载体转化至大肠杆菌(优选BL21)进一步克隆；2).将步骤2中克隆的重组载体采用酶切后，将目的基因连接到pBS101表达载体，得到重组质粒；3).将得到的重组质粒通过热击法转化进入枯草芽孢杆菌1A747表达宿主，收集转化的枯草芽孢杆菌1A747菌体；4).将转化的枯草芽孢杆菌1A747菌体涂布于LB培养基平板培养至单菌落出现。再一方面，本专利技术提供一种由上述方法得到的重组枯草芽孢杆菌。再一方面，本专利技术提供一种生产sublancin的方法，其中，在所述方法中使用上述重组枯草芽孢杆菌。另一方面，本专利技术提供上述重组枯草芽孢杆菌JY011802或上述重组枯草芽孢杆菌在发酵生产sublancin中的用途。有益效果本申请的重组枯草芽孢杆菌产sublancin的产量可以达到3100mg/L，是现有技术中sublancin产量的20倍之多，因此使用其可以大大提高sublancin生产的效率，因而其具有重要的经济价值。此外，本专利技术人对所得到的Sublancin也进行了全面的结构确证，结果与国内外文献报道一致，稳定性试验表明，Sublancin稳定性强、质量可控。附图说明图1为pJET1.2/Blunt克隆载体。图2为pBS101表达载体。图3为sublancin标准品峰面积与浓度的标准曲线。图4为圆二色谱仪检测Sublancin二级结构的检测图谱。图5为Sublancin样品的1H-15NHSQC。图6显示Sublancin的序列连接关系与自旋系统确定。图7为Sublancin三维结构示意图。图8显示糖基部分归属及NOE信息。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株重组枯草芽孢杆菌JY011802，其于2018年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.16667。/n

【技术特征摘要】
1.一株重组枯草芽孢杆菌JY011802，其于2018年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.16667。


2.一种生产重组枯草芽孢杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
1).将表达sublancin的目的基因片段连接到克隆载体得到重组克隆载体，再将所述重组克隆载体转化至大肠杆菌进一步克隆；
2).将步骤1)中克隆的重组克隆载体采用酶切后，将目的基因连接到pBS101表达载体，得到重组质粒；
3).将得到的重组质粒通过热击法转化进入枯草芽孢杆菌1A747表达宿主...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭良兴，
申请(专利权)人：湖州久元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33