2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法。该蛋白的制备方法包括下列步骤：预测：预测该蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列；表达：通过大肠杆菌包涵体表达的方式较大量的表达该蛋白；纯化：变性条件下通过杂蛋白洗涤以及亲和的方法纯化该蛋白；复性：较纯的蛋白在具有二硫键氧化还原对的环境中，运用稀释法使得该蛋白复性；纯化：复性后的目标蛋白通过离子柱，分子筛等纯化手段进一步去除杂蛋白，得到纯化的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。本发明专利技术提供的活性蛋白可与针对该表位的抗体结合，广泛用在化学发光以及胶体金等诊断试剂领域。

【技术实现步骤摘要】
2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法
本专利技术涉及本专利技术涉及生物技术检测领域，具体而言，涉及一种2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法。
技术介绍
新型冠状病毒COVID-19感染的肺炎以发热、乏力、干咳等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。迄今新型冠状病毒COVID-19还没有针对性的特效药。一些个案报道的治疗药物仍需更多的临床实践证明效果，相关疫苗的研发也在开展中，但距离临床应用尚需时间。当务之急是尽快研究有效的诊断试剂，早诊断、早隔离、切断传播途径，控制疫情蔓延。新型冠状病毒COVID-19核酸检测有较高的特异性和灵敏度，但是该检测方法对技术要求高，容易出现假阴性，标本需要特殊处理，要求具备PCR扩增仪及凝胶电泳等专业的仪器设备，对新型冠状病毒的检测用时长，需专业技术人员操作和判断检测结果，无法应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等基层的早期初步筛查。因此，亟需一种更早期、更准确、更快捷、更有效的检测新型冠状病毒COVID-19的诊断试剂，进行早期鉴别诊断，这种快速诊断试剂面临巨大的需求。抗体检测快速诊断试剂的核心原料是抗原，上述2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域是很好的目标分子。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法及其应用。本专利技术提供的技术方案如下：根据本专利技术的第一个方面，提供了一种2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白，该受体结合结构域蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术的第二个方面，提供了一种2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，该制备方法包括下列步骤：S1预测：预测所述的蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列；S2表达：通过大肠杆菌包涵体表达的方式表达所述的蛋白；S3纯化：变性条件下通过杂蛋白洗涤和亲和的方法纯化所述的蛋白，即获得目标蛋白；S4复性：在具有二硫键氧化还原对的复性液中，运用稀释法进行所述的目标蛋白复性；S5纯化：复性后的所述的目标蛋白通过离子柱、分子筛进一步纯化，去除杂蛋白，即得到纯化的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。进一步地，在步骤S3中，所述的杂蛋白洗涤包括二步洗涤：第一步：使用10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH7.4，1％曲拉通的溶液洗涤；以及第二步：使用10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH7.4的溶液洗涤。进一步地，所述的大肠杆菌包涵体表达包括大肠杆菌密码子优化的基因合成、大肠杆菌转化和表达、大肠杆菌破菌和大肠杆菌包涵体获得。进一步地，在步骤S4中，还包括将所述的大肠杆菌包涵体的溶解步骤。进一步地，所述的大肠杆菌包涵体的溶解步骤包括：将所述的大肠杆菌包涵体溶解到10毫升6-8摩尔/升尿素，用电磁搅拌器搅拌溶解2小时，12000转/分钟离心去除沉淀，将收获的上清液用于复性。进一步地，在步骤S4中，所述的二硫键氧化还原对为还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽。进一步地，在步骤S4中，所述的复性液的成分是10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH7.4，5毫摩尔/升还原型谷胱甘肽，0.5毫摩尔/升氧化型谷胱甘肽，300-400毫摩尔/升精氨酸。进一步地，在步骤S4中，所述的复性过程包括：将所述的目标蛋白以0.5毫升/分钟的速度滴入快速搅拌中的复性液中；放到4℃环境中复性12小时。进一步地，在步骤S5中，所述的目标蛋白的纯度大于等于90％。根据本专利技术的第三个方面，提供了上述的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白或上述的制备方法所得到的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白应用于2019新型冠状病毒诊断试剂。根据本专利技术的第四个方面，提供了一种2019新型冠状病毒抗原，该抗原包含上述的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白或上述的制备方法所得到的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。根据本专利技术的第五个方面，提供了一种2019新型冠状病毒的检测试剂盒，包括抗原试剂，该抗原试剂包含上述的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白或上述的制备方法所得到的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。本专利技术提供的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白，该受体结合结构域蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其制备方法通过以下技术方案得以实现：克隆2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区域的基因序列；将合成的基因序列插入pET21a表达载体中，该序列是根据大肠杆菌密码子的偏好性经过优化的，利用此表达载体转化BL21(DE3)，BL21(DE3)是一种工程化的细胞，用于体外大量表达目标蛋白，挑取单克隆，培养细胞，经诱导表达目标蛋白，再通过破菌，包涵体洗涤，包涵体复性，离子柱以及分子筛等柱纯化得到2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。本专利技术技术方案还提供了含2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的抗原，该蛋白是病毒编码的表面结构蛋白，通过与细胞表面的受体结合侵入到细胞，是疫苗研发的靶点，同时也是免疫试剂抗体检测的抗原，可以用作诊断试剂原料。本专利技术通过预测该蛋白的受体结合区域，构建该蛋白的表达质粒，利用多个组氨酸标签纯化富集该蛋白，通过包涵体复性的方法得到有特定功能结构域的蛋白，该活性蛋白可与针对该表位的抗体结合，广泛用在化学发光以及胶体金等诊断试剂领域。2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白用在胶体金法新冠病毒抗体检测试剂中，胶体金标记的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白用在试剂条的金垫上，抗人的抗体划线用作T线，该方案实施的胶体金检测试剂条具有特异性强，灵敏度高的特点。本专利技术的有益效果是：本专利技术可以使得面临突入其来的疫情，快速获得所需要的抗原，大概用一周的时间以较低成本制备出足量的抗原，用于诊断试剂的研发生产。附图说明图1是本专利技术一典型实施例制备方法的流程图；图2是本专利技术一典型实施例制备方法的流程图；图3是SDS-PAGE分析2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的纯化；图4.胶体金试纸条测试结果。具体实施方式下面将结合实施例来详细说明本专利技术。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供了一种2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白，该受体结合结构域蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。如图1所示，根据本专利技术一种典型的实施方式，提供了一种2019新型冠状病毒刺突蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括下列步骤：/nS1预测：预测所述的蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列；/nS2表达：通过大肠杆菌包涵体表达的方式表达所述的蛋白；/nS3纯化：变性条件下通过杂蛋白洗涤和亲和的方法纯化所述的蛋白，即获得目标蛋白；/nS4复性：在具有二硫键氧化还原对的复性液中，运用稀释法进行所述的目标蛋白复性；/nS5纯化：复性后的所述的目标蛋白通过离子柱、分子筛进一步纯化，去除杂蛋白，即得到纯化的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白的制备方法，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，包括下列步骤：
S1预测：预测所述的蛋白的受体结合结构域的氨基酸序列；
S2表达：通过大肠杆菌包涵体表达的方式表达所述的蛋白；
S3纯化：变性条件下通过杂蛋白洗涤和亲和的方法纯化所述的蛋白，即获得目标蛋白；
S4复性：在具有二硫键氧化还原对的复性液中，运用稀释法进行所述的目标蛋白复性；
S5纯化：复性后的所述的目标蛋白通过离子柱、分子筛进一步纯化，去除杂蛋白，即得到纯化的2019新型冠状病毒刺突蛋白受体结合结构域蛋白。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述的杂蛋白洗涤包括二步洗涤：
第一步：使用10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH7.4，1％曲拉通的溶液洗涤；以及
第二步：使用10毫摩尔/升的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，150毫摩尔/升的氯化钠，pH7.4的溶液洗涤。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的大肠杆菌包涵体表达包括大肠杆菌密码子优化的基因合成、大肠杆菌转化和表达、大肠杆菌破菌和大肠杆菌包涵体获得。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，还包括将...

【专利技术属性】
技术研发人员：穆海东，汪宁梅，李敏，
申请(专利权)人：上海裕隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31