修饰的腺病毒制造技术

本发明专利技术涉及修饰的溶瘤Ad5血清型腺病毒，包含该腺病毒的药物组合物，以及使用该腺病毒治疗癌症的方法，其中所述修饰的腺病毒包含六邻体高变区7中的至少一个防止病毒与凝血因子10(FX)结合的点突变(HVR7突变)；纤维球状突起区AB环中的至少一个防止病毒与柯萨奇腺病毒受体(CAR)结合的点突变(KO1突变)；以及五邻体整联蛋白结合基序Arg‑Gly‑Asp(RGD)中的至少一个防止病毒与α

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的腺病毒
本专利技术涉及修饰的溶瘤Ad5血清型腺病毒，包含该腺病毒的药物组合物；以及使用该腺病毒治疗癌症的方法，其中所述修饰的腺病毒包含六邻体高变区7中的至少一个防止病毒与凝血因子10(FX)结合的点突变(HVR7突变)；纤维球状突起区(fiberknobregion)AB环中的至少一个防止病毒与柯萨奇腺病毒受体(coxsackieandadenovirusreceptor,CAR)结合的点突变(KO1突变)；以及五邻体整联蛋白结合基序Arg-Gly-Asp(RGD)中的至少一个防止病毒与αVβ3/αVβ5整联蛋白结合的点突变。
技术介绍
癌症病毒疗法是快速兴起的领域，基于1型单纯疱疹的TalimogeneLaherparepvec(T-VEC)是首个用于晚期黑素瘤的溶瘤免疫疗法。溶瘤腺病毒是高免疫原性病毒，经常用于各种针对感染病的疫苗方法中。重要的是，它们具有引发和增强免疫应答的出色能力。而且，肿瘤中溶瘤腺病毒的存在及其引起的免疫原性细胞死亡很可能通过使TH1型免疫调节剂例如IFNg表达，使敌对的肿瘤微环境朝着发生临床相关抗肿瘤免疫力的更易感状态发展。然而，溶瘤腺病毒的免疫原性是一把双刃剑，抗病毒免疫力通常如此势不可挡，以至于它可以抵消针对肿瘤表达的自身抗原引起的弱得多的免疫应答。腺病毒5(Ad5)是许多癌症和基因疗法临床试验中使用的常见载体(clinicaltrials.gov,2016)，因为它可以进行基因操作，并且可以耐受大的转基因。然而，这种血清型具有几个妨碍了其更广泛临床应用的次优特征。Ad5是常见的呼吸道病毒，在某些人群中血清阳性率接近100％-中和抗体(nAb)迅速使系统递送的治疗载体失活。其他次优特征包括它通过桥接病毒六邻体蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)广泛地脱靶隔离于脾脏和肝脏，这是人凝血因子10(FX)介导的向性决定的相互作用(tropism-dictatinginteraction)。在体外，Ad5通过病毒纤维蛋白与柯萨奇腺病毒受体(CAR)之间的相互作用进入宿主细胞，后者在极化上皮细胞的紧密连接内普遍表达，但在进行性癌症中下调。随后，Ad5通过病毒五邻体基底蛋白介导的网格蛋白介导的内吞作用，经由αvβ3/5整联蛋白在宿主细胞中内化。在过去的十年中，随着免疫疗法和刺激患者自身免疫系统靶向和攻击癌症的流行，对溶瘤病毒在癌症治疗中作用的认识发生了巨大变化。在本世纪初，溶瘤病毒被认为是癌症治疗中的活性剂，仅通过其经由溶瘤作用裂解肿瘤细胞的固有能力起作用。近来，它们作为癌症疫苗的用途受到关注，并且它们在溶瘤后从癌细胞中释放肿瘤抗原来激活免疫系统的能力被认为是设计针对癌症的最终免疫疗法的重要特征。因此，病毒载体在临床环境中变得越来越有吸引力，但是，常见的血清型即Ad5的临床疗效因肿瘤特异性差、广泛的脱靶递送和先天性免疫失活而受到阻碍，因此，需要创新的处理策略。我们在此公开了设计用于克服上述缺点的修饰的腺病毒载体。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，提供了修饰的Ad5血清型腺病毒，其包含：a)六邻体高变区7中的I421G、T423N、E424S、E450Q或L426Y点突变中的至少一个(HVR7突变)，其中所述突变防止病毒与凝血因子10(FX)结合；b)纤维球状突起区AB环中的S408E或P409A点突变中的至少一个(KO1突变)，其中所述突变防止病毒与柯萨奇腺病毒受体(CAR)结合；和c)五邻体整联蛋白结合基序Arg-Gly-Asp(RGD)中的D342E或D342A点突变中的至少一个，其中所述突变防止病毒与αVβ3/αVβ5整联蛋白结合。本专利技术的修饰的Ad5血清型腺病毒是有利的，因为其感染脱靶组织的能力受到严重损害，实际上，它对肝脏和脾脏的感染受到阻止和抑制，并且其广泛感染体细胞的能力也受到损害。因此，就可感染的组织而言，修饰的腺病毒受到损害。腺病毒是中等大小的(90–100nm)、无包膜(无外部脂质双层)病毒，其二十面体核衣壳含有双链DNA基因组。在人类中，有57种公认的人类腺病毒血清型(Ad-1至57)，分为7种(人类腺病毒A至G)：A-12、18、31；B-3、7、11、14、16、21、34、35、50、55；C-1、2、5、6、57；D-8、9、10、13、15、17、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、36、37、38、39、42、43、44、45、46、47、48、49、51、53、54、56；E–4；F-40、41以及G–52。因此，本文中提到Ad5是指属于腺病毒C亚类的血清型5腺病毒。如本领域技术人员已知的，腺病毒病毒体由围绕病毒DNA-蛋白核心复合物的非包封的二十面体形衣壳组成。六邻体是最丰富的结构蛋白，每个衣壳中有240拷贝的三聚体分子。十二拷贝的六邻体三聚体形成衣壳的20个三角面中的每一个。五邻体基底蛋白和纤维蛋白的复合物封闭了衣壳的顶点，并促进了病毒的吸附(纤维)和内化(五邻体基底)。除了9种高变区(HVR)之外，六邻体蛋白在不同的腺病毒血清型之间是高度保守的。这些HVR位于两个形成六邻体蛋白暴露表面的不同环中，HVR1–6位于DE1环中，而HVR7–9位于FG1环中。因此，本文中提到HVR7的至少一个突变是指高变区7中的突变。具体而言，所述至少一个HVR7突变防止与凝血因子X的相互作用，从而限制了修饰的腺病毒脱靶隔离于肝脏，以及改善靶向靶癌细胞。在优选的实施方案中，所述至少一个HVR7突变包含至少一个防止FX相互作用的氨基酸取代突变，所述氨基酸取代突变选自I421G，T423N、E424S、E450Q或L426Y中的一个或多个。最优选地，所述至少一个HVR7突变另外或可替代地包含I421G、T423N、E424S和L426Y点突变中的至少一个。如本领域技术人员所知，腺病毒载体具有导致该载体广泛分布的天然向性。C群腺病毒例如Ad5进入细胞被认为涉及病毒通过病毒纤维蛋白与柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)相互作用对细胞的高度亲和结合。因此，出于抗癌治疗的目的，腺病毒载体靶向特异性组织或细胞类型需要修饰载体的正常向性，以提高特异性。腺病毒感染开始于通过病毒表面上的专门蛋白识别宿主细胞受体，即腺病毒纤维蛋白，特别是腺病毒纤维蛋白的球状羧基末端结构域，称为羧基末端球状突起结构域。因此，本文中提到腺病毒纤维蛋白的球状突起是指腺病毒纤维蛋白的球状羧基末端结构域。因此，提到至少一个KO1突变是指纤维球状突起区AB环中的至少一个突变。具体而言，所述至少一个KO1突变防止病毒与CAR结合。在优选的实施方案中，所述至少一个KO1突变包含至少一个防止CAR结合的点突变，所述点突变选自S408E或P409A中的一个或多个。最优选地，所述点突变包含S408E和P409A点突变。腺病毒五邻体基底包含五个Arg-Gly-Asp序列，并结合整联蛋白αvβ3和αvβ5(αVβ3/αVβ5)，从而通过允许病毒内化来促进病毒感染。通过防止这种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.修饰的Ad5血清型腺病毒，包含：/na)六邻体高变区7中的I421G、T423N、E424S、E450Q或L426Y点突变中的至少一个(HVR7突变)，其中所述突变防止病毒与凝血因子10(FX)结合；/nb)纤维球状突起区AB环中的S408E或P409A点突变中的至少一个(KO1突变)，其中所述突变防止病毒与柯萨奇腺病毒受体(CAR)结合；和/nc)五邻体整联蛋白结合基序Arg-Gly-Asp(RGD)中的D342E或D342A点突变中的至少一个，其中所述突变防止病毒与α

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180216 GB 1802539.51.修饰的Ad5血清型腺病毒，包含：
a)六邻体高变区7中的I421G、T423N、E424S、E450Q或L426Y点突变中的至少一个(HVR7突变)，其中所述突变防止病毒与凝血因子10(FX)结合；
b)纤维球状突起区AB环中的S408E或P409A点突变中的至少一个(KO1突变)，其中所述突变防止病毒与柯萨奇腺病毒受体(CAR)结合；和
c)五邻体整联蛋白结合基序Arg-Gly-Asp(RGD)中的D342E或D342A点突变中的至少一个，其中所述突变防止病毒与αVβ3/αVβ5整联蛋白结合。


2.根据权利要求1所述的修饰的腺病毒，其中所述HVR7突变包含以下点突变中的至少一个或由其组成：I421G、T423N、E424S和L426Y。


3.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的腺病毒，其中所述KO1突变包含S408E和P409A点突变或由其组成。


4.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的腺病毒，其中所述RGD突变是产生RGE的D342E。


5.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的腺病毒，其中所述腺病毒经进一步修饰而包括至少一个选择性靶向肿瘤细胞的癌症靶向修饰或序列。


6.根据权利要求5所述的修饰的腺病毒，其中所述腺病毒包含至少一个结合氨肽酶N的(含)NGP肽基序，其中所述NGR在腺病毒纤维蛋白的HI环中；或至少一个与泛癌标志物EphA2结合的(含)YSA肽基序，其中所述YSA在嵌合纤维中，或至少一种癌症靶向抗体或至少一种生长因子抗体或至少一种基质降解酶。


7.根据权利要求5所述的修饰的腺病毒，其中所述癌症靶向修饰包括将αvβ6整联蛋白结合肽或A20肽序列NAVPNLRGDLQVLAQKVART(SEQIDNO:1)插入所述病毒或通过所述病毒表达。


8.根据权利要求7所述的修饰的腺病毒，其中所述A20肽序列被插入所述病毒纤维球状突起HI环中或在其中表达。


9.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的腺病毒，其中所述腺病毒(Ad5.3D.A20)包含：
a)六邻体高变区7中的I421G、T423N、E424S、E450Q或L426Y点突变中的至少一个(HVR7突变)，其中所述突变防止病毒与凝血因子10(FX)结合；
b)纤维球状突起区AB环中的S408E或P409A点突变中的至少一个(KO1突变)，其中所述突变防止病毒与柯萨奇腺病毒受体(CAR)结合；
c)五邻体整联蛋白结合基序Arg-Gly-Asp(RGD)中的D342E或D342A点突变中的至少一个，其中所述突变防止病毒与αVβ3/αVβ5整联蛋白结合；和
d)在所述病毒纤维球状突起HI环中插入或表达A20肽序列NAVPNLRGDLQVLAQKVART(SEQIDNO:1)。


10.根据权利要求8所述的修饰的腺病毒，其中修饰的腺病毒(Ad5.3D.A20)包含：
a)六邻体高变区7中的I421G、T423N、E424S和L426Y点突变(HVR7突变)，其中所述突变防止病毒与凝血因子10(FX)结合；
b)所述纤维球状突起区AB环中的S408E和P409A点突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·帕克，H·尤斯喀图拉，
申请(专利权)人：加的夫大学学院咨询有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB