猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒，属于免疫检测技术领域。本发明专利技术提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术所述应用制备得到的试剂盒检测特异性好，通量高，具有重要的临床使用价值，且检测快速，精准，能够实现猪场中PCV4的流行病学检测，也可以用于疫苗免疫后猪血清中PCV4抗体的评价。

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒
本专利技术涉及免疫检测
，具体涉及猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒。
技术介绍
猪圆环病毒(PCV)是一种基因组为环状、单链的DNA病毒，根据基因组特征，目前已发现PCV1、PCV2、PCV3和PCV4四种基因型。其中，PCV1可在猪群中检出，但不致病；PCV2是引起猪断奶后衰竭综合症的主要病原；PCV3是一种与母猪皮炎综合征和繁殖障碍相关的病毒；最新发现的猪圆环病毒4型(PCV4)可能引起猪呼吸道、消化道等多种疾病，且可能与猪皮炎与肾病综合征密切相关。目前，该病毒已在我国多省份均有报道，临床检测主要依靠普通PCR、实时荧光PCR等核酸检测方法为主。目前，该病毒尚未成功分离，且无商品化疫苗进行免疫，因此，血清学检测为阳性即可判断PCV4感染。但目前缺少一种该病毒的现场快速、精准检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒。本专利技术所述应用制备得到的试剂盒检测特异性好，通量高，具有重要的临床使用价值，且检测快速，精准，能够实现猪场中PCV4的流行病学检测，也可以用于疫苗免疫后猪血清中PCV4抗体的评价。本专利技术提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测疫苗免疫后猪血清中猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备诊断猪圆环病毒4型疾病的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：包被猪圆环病毒4型特异性抗原的ELISA酶标板、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、封闭液、洗涤液、酶标二抗液、显色液和反应终止液；所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的是，所述阴性对照包括猪圆环病毒4型抗体阴性的猪血清，所述阳性对照包括猪圆环病毒4型抗体阳性的猪血清。优选的是，所述试剂盒中，当猪圆环病毒4型特异性抗原包被的质量浓度为10μg/mL时，若OD450>0.34，判定结果为阳性。本专利技术提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用。本专利技术所述应用检测特异性好，不与其它猪圆环病毒包括PCV1、PCV2和PCV3存在血清学交叉反应，可用于临床血清样品中PCV4的抗体检测，能够快速、特异、高通量地用于PCV4血清学检测，具有良好的临床应用价值；而且本专利技术应用相关的试剂盒可用于大规模临床血清样品中PCV4抗体的检测，具有特异性好、灵敏度高、检测时间短、通量高等技术优势，具有重要的临床实用价值和广阔的市场应用前景。具体实施方式本专利技术提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示(GHYDFKLKDFIPKGPGTIVNLYSLPFA)。本专利技术所述猪圆环病毒4型特异的抗原为PCV4特异性氨基酸序列，与其它猪圆环病毒包括PCV1、PCV2、PCV3不存在血清学交叉反应。具体的，本专利技术优选体外合成上述PCV4特异性氨基酸序列用于包被抗原的制备，进而得到的试剂盒能够实现血清样品中PCV4特异性抗体的间接ELISA检测。本专利技术还提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测疫苗免疫后猪血清中猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了猪圆环病毒4型特异的抗原在制备诊断猪圆环病毒4型疾病的试剂盒中的应用，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：包被猪圆环病毒4型特异性抗原的ELISA酶标板、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、封闭液、洗涤液、酶标二抗液、显色液和反应终止液；所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术中，所述试剂盒优选还包括ELISA包被液，所述ELISA包被液能够有效活化抗原，充分暴露抗体识别的抗原决定簇，所述ELISA包被液的制备方法包括：NaCO31.59g，NaHCO32.93g溶于1L蒸馏水中，调节pH＝9.6。在本专利技术中，所述洗涤液的制备方法优选包括：取NaCl8g，KH2PO40.25g，Na2HPO42.13g，KCl0.2g和吐温-200.5mL，用去离子水定容至1L，调节pH值为7.4。在本专利技术中，所述封闭液的制备方法优选包括：取BSA0.5g，酪蛋白0.025g定溶于10mL洗涤液中。在本专利技术中，所述显色液(底物显色液)优选包括A液：柠檬酸21g溶于1L去离子水中，B液：磷酸氢二钠71.6g溶于1L去离子水中；使用前取4.86mLA液、5.14mLB液，加入邻苯二胺10mg混匀后加入37.5μl30％H2O2。在本专利技术中，所述反应终止液的制备方法优选包括在177.8mL的蒸馏水中加入22.2mL浓硫酸混匀。在本专利技术中，所述阴性对照包括猪圆环病毒4型抗体阴性的猪血清，所述阳性对照包括猪圆环病毒4型抗体阳性的猪血清。在本专利技术中，所述试剂盒中，当猪圆环病毒4型特异性抗原包被的质量浓度为10μg/mL时，若OD450>0.34，判定结果为阳性。下面结合具体实施例对本专利技术所述的猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒做进一步详细的介绍，本专利技术的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例1PCV4型特异性抗原的筛选与制备1PCV4型特异性抗原的筛选。通过比对不同圆环病毒基因型氨基酸序列，筛选到GHYDFKLKDFIPKGPGTIVNLYSLPFA氨基酸序列，该肽段与PCV1、PCV2、PCV3氨基酸同源序列最低，具有良好的抗原反应原性。2PCV4间接ELISA方法的初步建立2.1抗原包被浓度的确定将PCV4抗原用包被液稀释至蛋白含量分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，加至96孔酶标板中，每孔加100μL，4℃放置过夜。次日，甩掉孔内液体，用300μL洗涤液洗涤2次，每次3分钟，拍干。2.2封闭在酶标板中加入封闭液，每孔100μL，37℃作用30分钟。2.3加一抗弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，加入1:200倍稀释的PCV4阴性、阳性血清样品，每孔100μL，37℃作用30分钟。2.4加酶标二抗弃去一抗，用洗涤液洗涤3次，加入1:5000倍稀释的酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，其特征在于，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，其特征在于，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测疫苗免疫后猪血清中猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用，其特征在于，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.猪圆环病毒4型特异的抗原在制备诊断猪圆环病毒4型疾病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述猪圆环病毒4型特异的抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


4.一种检测猪圆环病毒4型抗体的试...

【专利技术属性】
技术研发人员：李向东，刘金彪，陈昌海，范娟，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32