【技术实现步骤摘要】
一种筛查急性淋巴细胞白血病高危亚型的引物组合及方法
本专利技术涉及生物制药领域，具体是一种筛查急性淋巴细胞白血病高危亚型的引物组合及方法。
技术介绍
急性淋巴细胞白血病(AcuteLymphoblasticLeukemia，ALL)是一类高度危害人类健康的血液系统恶性肿瘤，按照其具体的细胞起源又可分为B细胞性急性淋巴细胞白血病(BcellAcuteLymphoblasticLeukemia，B-ALL)和T细胞性急性淋巴细胞白血病(TcellAcuteLymphoblasticLeukemia，T-ALL)，B-ALL和T-ALL约各占所有ALL的80％和20％。传统的形态学结合流式免疫分型已不能满足精准医疗时代对ALL患者诊断的需求。随着高通量测序技术的发展，越来越多的与ALL患者疾病相关的分子学异常逐渐被发现。携带有这些分子学异常的患者往往临床治疗困难，容易复发，预后不佳，属于急性淋巴细胞白血病的高危亚型。因此，开发用于筛查急性淋巴细胞白血病的高危亚型的引物组合和方法将有极大的临床价值和应用前景。目前，临床上对融合基因的检测主要依靠实时荧光定量PCR技术。通过在融合位点的两端设计特异性引物进行PCR扩增以及荧光信号的采集来判断患者是否存在对应的融合基因，检测结果灵敏，特异性高。然而，由于急性淋巴细胞白血病的高危亚型涉及到的融合基因众多，如对所有融合位点分别设计引物进行单独检测不仅会极大增加检测者的工作量和检测试剂的消耗，而且检测所需的标本量大，检测周期长，无法满足临床早期，快速，准确获取检测结果从而对高危...
【技术保护点】
1.一种筛查急性淋巴细胞白血病高危亚型的引物组合，引物组合包括相关融合基因的引物组合和相关基因突变的引物组合，其特征在于，所述相关融合基因的引物组合包括检测55种融合基因的66对引物，共12个引物池，序列如R1-R12所示，相关基因突变的引物组合包括206个检测位点的125对引物，共2个引物池，分别为第一个引物池M1和第二个引物池M2。/n
【技术特征摘要】
1.一种筛查急性淋巴细胞白血病高危亚型的引物组合，引物组合包括相关融合基因的引物组合和相关基因突变的引物组合，其特征在于，所述相关融合基因的引物组合包括检测55种融合基因的66对引物，共12个引物池，序列如R1-R12所示，相关基因突变的引物组合包括206个检测位点的125对引物，共2个引物池，分别为第一个引物池M1和第二个引物池M2。
2.根据权利要求1所述的一种筛查急性淋巴细胞白血病高危亚型的引物组合，其特征在于，所述相关基因突变的引物组合中125对引物中，65对引物组成第一个引物池M1，第一个引物池M1序列包括M1-1f～M1-65f和M1-1R～M1-65R，60对引物组成第二个引物池M2，第二个引物池M2序列包括M2-1f～M2-60f和M2-1R～M2-60R。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的一种筛查急性淋巴细胞白血病高危亚型的引物组合的检验方法，其特征在于，所述相关融合基因引物组合中的66对引物和相关基因突变引物组合中的125对引物检测方法，步骤如下：
S1、急性淋巴细胞白血病患者白血病细胞的分离；
S2、细胞总RNA的提取和cDNA的制备；
S3、细胞基因组DNA的提取；
S4、融合基因检测引物和探针的准备；
S5、DNA文库构建，测序。
4.根据权利要求3所述的一种筛查急性淋巴细胞白血病高危亚型的引物组合的检验方法，其特征在于，所述步骤S1中分离方法：
1.1、将采血管配平后置于低速离心机中，2500rpm×5min，离心后缓慢吸弃上层血浆，用无菌生理盐水将剩下的血细胞稀释至5mL，充分吹打混匀；
1.2、取15mL离心管，标记患者姓名后加入5mL人淋巴细胞分离液，再沿管壁缓慢将骨髓稀释液滴加于淋巴细胞分离液之上，形成分层，避免两者混合；
1.3、采用密度梯度离心法，将离心管置于低速离心机中，2000rpm×20min，离心后管中液体分为三层，上层清亮层为稀释的血浆和血小板，中间白膜层为单个核细胞，下层红色层为粒细胞和红细胞；
1.4、缓慢吸取中间单个核细胞层，放置于另一标记患者姓名的洁净离心管中，加入10mL无菌生理盐水吹打混匀后置于低速离心机离心，2000rpm×5min，弃上清；
1.5、用1mL无菌生理盐水重悬洗涤后的细胞团块，在高倍显微镜下用细胞计数板计数，计算总细胞量，细胞计数液为1％的冰醋酸，20μL细胞悬液加入到380μL的1％冰醋酸中吹打混匀，吸20μL加入到细胞计数板，镜下计数16个格子里的细胞数n，则细胞总量为n×10000×20；
1.6、将细胞悬液稀释到1×107个单个核细胞/mL，1.5mLEP管中分装细胞悬液，每管1mL，配平后，8000rpm高速瞬时离心，小心吸弃上清，勿触及管底细胞沉淀，一管在管壁标注好编号和患者姓名，另一管在管壁标注好编号和患者姓名后加入1mLTrizol混匀。
5.根据权利要求3所述的一种筛查急性淋巴细胞白血病高危亚型的引物组合的检验方法，其特征在于，所述步骤S2中的制备方法：
2.1、取500μLTrizol混合液于另一无RNA酶的1.5mLEP管中，加入200μL氯仿，剧烈震荡至充分混匀，室温静置10min，4℃离心，12000rpm×15min，离心后溶液分为三层，上层为澄清透明无色水相，中间的白膜层主要为蛋白质和DNA，下层为有机相；
2.2、缓慢吸收上层溶液200μL至新的无RNA酶的0.6mlEP管中，吸头随液面缓慢下移，避免吸入中间蛋白质和DNA层，加入等体积-20℃预冷的异丙醇，盖好管盖后轻柔颠倒混匀，-20℃静置10min，使RNA充分沉淀，4℃离心，12000rpm×10min，弃去上清，得到沉淀；
2.3、加入500μL-20℃预冷的75％乙醇，无水乙醇和DEPC水配比3:1，4℃离心，12000rpm×15min，缓慢弃上清，用移液器小心将残留的乙醇吸去；
2.4、置于超净台上，室温静置，待未吸净的乙醇完全挥发，RNA白色沉淀呈半透明；
2.5、加入20μLDEPC水至管底，轻柔吹打，充分溶解沉淀，低速瞬离，使用紫外分光光度仪检测RNA浓度和纯度，A260/280比值在1.8-2.0间的RNA质量符合要求，接着将RNA逆转录成cDNA；
2.6、用逆转录试剂盒进行逆转录反应，配制20μL反转录体系：DEPC水补足至20μL，反转录反应条件：37℃：15min，反转录酶的灭活反应条件：85℃：5s，4℃保存，逆转录所得cDNA用于多重PCR融合基因的检测。
6.根据权利要求4所述的一种筛查急性淋巴细胞白血病高危亚型的引物组合的检验方法，其特征在于，所述步骤S3中DNA的提取纯化方法为硅膜吸附法，步骤如下：
3.1、将分离得到的1×107个急性淋巴细胞白血病患者白血病细胞溶解于200μLPBS中，管底加入20μL蛋白酶K；
3.2、缓慢加入200μL油状裂解液AL，震荡混匀后低速瞬离；
3.3、56℃水浴20min，待油状混合液变澄清，擦净外壁液体后低速瞬离，将黏附在内壁和管盖的液体离心至管底；
3.4、加入200μL无水乙醇，颠倒混匀，低速瞬离；
3.5、将混合液转移至吸附柱中，吸附柱置于试剂盒提供的2mL收集管上，盖好管盖，做好标记，高速离心12000rpm×3min，丢弃收集管及滤液；
3.6、吸附柱放入新的收集管中，在吸附柱中加入500μL缓冲液AW1，盖好管盖并离心，12000rpm×3min，丢弃收集管及滤液；
3.7、吸附柱放入新的收集管中，加入500μL缓冲液AW2，盖好管盖并离心，12000rpm×3min，丢弃收集管及滤液；
3.8、将吸附柱置于自备的清洁无菌1.5mLEP管中，打开吸附柱管盖，离心12000rpm×3min，使乙醇充分挥发，丢弃EP管及滤液；
3....
【专利技术属性】
技术研发人员：葛峥，韩旗，葛芹玉，訾杰，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。