用于人甲状腺癌基因融合试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了分子生物技术领域的一种用于人甲状腺癌基因融合试剂盒及检测方法，本试剂盒采用多重PCR捕获技术和NGS测序技术，用于定性检测甲状腺结节穿刺活检细胞学不确定的新鲜组织样本中CCC6‑RET,NCOA4‑RET，PAX8/PPARG,ETV6‑NTRK3融合基因的多种变异，根据分子标签确定了检测阈值，通过本试剂盒融合位点的检测，并结合临床病理分析结果，可为甲状腺癌的辅助诊断和治疗提供帮助。

【技术实现步骤摘要】
用于人甲状腺癌基因融合试剂盒及检测方法
本专利技术涉及分子生物
的一种用于人甲状腺癌基因融合试剂盒及检测方法。
技术介绍
甲状腺癌是人内分泌器官中最常见的肿瘤，约占人类全部恶性肿瘤的4％，近年来其发病率在中国和全世界正在稳步增长。甲状腺癌，按病理类型可分为乳头状癌(PTC)、滤泡状癌(FTC)、未分化癌(ATC)和髓样癌(MTC)。其中，PTC与FTC合称为分化型甲状腺癌(DTC)，约占甲状腺癌的85％-90％。分化型甲状腺癌(DTC)通常发展于甲状腺结节。此类结节在人群中普遍发生，特别是随着年龄的增长，发生率也伴随上升。然而，大多数甲状腺结节是良性的，临床上需要准确和迅速地识别恶性结节，并通过手术切除。在甲状腺结节的诊断方法中，超声引导细针穿刺(FNA)加以细胞学检查是一种常见的诊断方法(以下简称FNA细胞学检查)，此套方法在大多数情况下能够可靠的诊断癌症或良性结节。然而，在大约25％的结节中，FNA细胞学检查不能排除癌症的存在，从而阻碍了临床管理。此类剩余的、不能排除癌症的结节落入由贝塞斯达(Bethesda)分类系统定义的III，IV和V类结节，预期癌症风险分别为5-15％，20-30％和50-75％。这些结节中癌症风险的不确定性使得许多人接受了诊断性手术，但这些手术在许多良性结节患者中可以避免。近十年来，精准医学飞速发展，通过前人的研究，我们对甲状腺癌分子靶点和相关信号通路已经逐步深入了解。现已经证实甲状腺癌是多种基因改变积累的结果，这些基因的改变是重要的诊断、预后和预测性生物标记物。如：乳头状癌(PTC)中最常见的突变是BRAF和RAS基因的点突变和RET/PTC重组，所有这些突变都能够激活线粒体激活蛋白激酶(MAPK)通路从而加速癌症的发生和发展；滤泡状癌(FTC)常含有RAS突变或PAX8/PPARγ重排。涉及PIK3CA/AKT信号通路(PIK3CA，PTEN突变)、TP53、AKT1和CTNNB1基因的突变常发生在晚期和未分化癌(ATC)中；髓样癌(MTC)常携带位于RET和RAS基因中的点突变。基于前人的研究结果，NCCN和ATA等指南及专家共识均指出基因检测可辅助诊断甲状腺结节的良恶性，对于FNA不能确定良恶性的结节患者，推荐进行基因检测辅助鉴别。同时，基因检测也可以辅助甲状腺癌患者的预后评估以及用药指导：如甲状腺癌中BRAF等基因突变可提示复发风险，辅助患者的分子分型及风险分层。多种药物已被FDA批准用于甲状腺癌，基因检测可提示患者靶向药物获益。BRAF、RAS、PIK3CA、PTEN、TP53、AKT1和CTNNB1等人甲状腺相关基因的突变多为点突变或微小的indel，临床上常以DNA为投入，使用qPCR方法进行检测，由于DNA在临床样本中相对稳定，且提取量较大，维持现行临床检验方法并不需要做过多优化。对于融合检测，目前临床上基因融合检测的金标准是荧光原位杂交(FISH)。虽然FISH敏感性高，但存在着：仅能检测已知的某一种融合，样本用量较大且特异性差。RNA核酸，由于直接体现了融合基因和融合伙伴基因的外显子拼接情况，目前已经是融合基因临床检验的首选材料，目前也陆续有公司基于RNA水平的外显子拼接，使用RT-PCR法来检测融合，常用的为ARMS-PCR和数字PCR，其优点为灵敏度高，特异性好，但其通量小，一次只能检测几种已知的融合。如果需要覆盖甲状腺癌常见的几种融合类型，需要大量的RNA核酸，这和FNA组织的微小RNA量是相悖的。随着高通量测序技术的快速发展，基于NGS技术检测融合基因的方式也逐渐被应用且被接受。目前市场上基于二代测序平台的检测试剂盒常见的为基于DNA水平的探针捕获法建库，但成本高操作流程繁琐；而RNA水平的逆转录加多重PCR技术，结合了qPCR的灵敏度和特异性以及NGS技术结果的直观性，操作简便，耗时短，只需一份样本即可检测所有融合类型，具有突出的方法学优势。然而在现有的很多技术方案中，大多是先对RNA逆转为cDNA，再用cDNA进行文库的构建(专利号：CN111088365A,CN110241215A,CN109371139A)，这些方法不仅增加了实验操作流程，提高了污染的风险，而且其检测融合基因信息相对较少，临床使用受限。目前现有的技术(专利号：CN104894271A)融合阳性阈值依据于reads数值进行界定，此方法极不稳定，易受限于测序数据量，方法学等各种因素干扰。分子标签是将样本中每个核酸片段都接上一段随机序列，这样每个原始样本中都有了自己的唯一的标签。我们可以通过野生型和融合型各自的标签来区分不同的原始分子进而精确定量原始RNA中的融合比值。此方法可以稳定准确的追溯到原始的融合阳性状态，解决了现存的融合检测难题。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种不仅灵敏、准确、操作简便，而且针对甲状腺癌融合基因检测的高通量测序检测试剂盒，以实现对临床甲状腺癌病变的检测与辅助诊断。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种甲状腺癌基因融合检测点，其特征在于：所述甲状腺癌基因融合检测点如下表1融合基因及融合类型所示：表1融合基因及融合类型一种用于人甲状腺癌基因融合试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括RNA提取试剂盒、RNA逆转录酶、多重PCR扩增引物、PCR反应液、纯化磁珠、NGS建库接头、阳性对照和阴性对照；优选地，所述试剂盒通过特异性引物对目标序列进行PCR扩增，扩增产物经磁珠纯化富集后进行二轮PCR富集扩增，最后经磁珠纯化得到测序文库；优选地，所述逆转录和第一轮PCR(目标区域的扩增)反应在单管内完成。一种用于人甲状腺癌基因融合试剂盒的检测方法，检测流程包括以下步骤：1)RNA的提取：应用RNA提取试剂盒提取穿刺组织样本中的RNA；2)逆转录和特异性片段的扩增：逆转录和第一轮PCR(特异性目的片段的扩增)反应在单管内完成。以RNA为模板，带有6个随机碱基的融合3’端基因反向引物作为逆转录特异性引物，获得cDNA；用特异性多重PCR引物和扩增试剂对cDNA进行扩增，得到特异性目的片段；3)产物纯化：在步骤(2)获得的PCR扩增产物中加入定量的磁珠进行纯化，去除RNA和残余扩增引物；4)连接测序接头：在步骤(3)获得的纯化产物中加入NGS建库试剂中的特异性标签和接头试剂，PCR扩增得到文库片段；5)文库检测：将步骤(4)制备好的文库用Qubit进行定量，并用AgilientBioanalyzer2100或同等功能的仪器进行质检，检测文库的浓度以及文库的片段大小，确保最终文库片段在220-250bp范围之间；6)上机测序：将步骤(5)检测合格的文库环化后用华大MGI测序平台进行高通量测序；7)生物信息学分析软件对数据结果分析。本专利技术的有益效果是：本专利技术的试剂盒采用多重PCR捕获技术，分别设计了针对CCC6-RET，NCOA4-RET，PAX8-PPARG，ETV6-NTRK3的引物,特异性筛选了甲状腺中低表达管家基因TBP和HMBS，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甲状腺癌基因融合检测点，其特征在于：所述甲状腺癌基因融合检测点如表1融合基因及融合类型所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种甲状腺癌基因融合检测点，其特征在于：所述甲状腺癌基因融合检测点如表1融合基因及融合类型所示。


2.一种用于人甲状腺癌基因融合试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括RNA提取试剂盒、RNA逆转录酶、多重PCR扩增引物、PCR反应液、纯化磁珠、NGS建库接头、阳性对照和阴性对照。


3.根据权利要求2所述的用于人甲状腺癌基因融合试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过带有分子标签的特异性引物对目标序列进行PCR扩增，扩增产物经磁珠纯化富集后进行二轮PCR富集扩增，最后经磁珠纯化得到测序文库。


4.根据权利要求2所述的用于人甲状腺癌基因融合试剂盒，其特征在于：所述RNA逆转录和第一轮PCR(目标区域的扩增)反应在单管内完成。


5.一种用于人甲状腺癌基因融合试剂盒的检测方法，其特征在于：检测流程包括以下步骤：
1)RNA的提取：应用RNA提取试剂盒提取穿刺组织样本中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宝霞，胡春旭，高伙妮，何文天，包文静，
申请(专利权)人：上海睿璟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31