眼斑水龟性别相关微卫星标记的鉴别引物、试剂盒和鉴别方法技术

本发明专利技术公开了眼斑水龟性别相关微卫星标记的鉴别引物、试剂盒和鉴别方法。微卫星位点tSb‑SSR12特异性引物：F:TCTGGAGTCCATAGCTGC；R:CTCACATTGACGAAAGGC。本发明专利技术发现了眼斑水龟微卫星位点tSb‑SSR12的新用途，该位点与眼斑水龟性别呈显著相关(P<0.05)，因此能够应用于眼斑水龟雌雄遗传差异分析、成体和幼体性别鉴定等工作。

【技术实现步骤摘要】
眼斑水龟性别相关微卫星标记的鉴别引物、试剂盒和鉴别方法
：本专利技术属于分子标记
，具体涉及一种眼斑水龟性别相关微卫星标记的鉴别引物、试剂盒和鉴别方法。
技术介绍
：眼斑水龟(Sacaliabealei)隶属于龟鳖目(Tesudines)、地龟科(Geoemydidae)、眼斑龟属(Sacalia)，是中国特有淡水龟类，主要分布于广东、广西、海南、福建、安徽、江西、贵州、香港等地，在山区溪流中生活。眼斑水龟肉质细腻且无异味，滋补作用明显，具有很高的食用和药用价值，是一种重要的经济淡水龟。在眼斑水龟养殖中，养殖种源主要从野外获取和补充，然而，近年来随着环境污染和破坏，眼斑水龟野外种群急剧减少。为了有效保护野生种质资源，发展养殖业，需要尽快增加眼斑水龟数量，扩大种群规模。在种源不足的情况下，因雌性可以产卵，增加雌龟养殖比例可以加快种群数量增长速度，提高经济产值。因此，在眼斑水龟发育早期鉴定其性别，对促进眼斑水龟水产养殖业的可持续发展具有重要作用。由于三龄前幼龟第二性征分化不明显，雌雄个体间表型差异小，无法从形态上鉴别雌雄，而基于DNA分子标记技术的性别鉴定方法可以克服以上困难，通过筛选性别连锁分子标记在发育早期鉴定性别，目前，尚未见眼斑水龟性别相关微卫星标记的相关报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物。本专利技术的眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物如下所示：微卫星位点tSb-SSR12特异性引物：F:TCTGGAGTCCATAGCTGCR:CTCACATTGACGAAAGGC本专利技术通过分析7个眼斑水龟微卫星标记在雌雄群体中的扩增结果，发现了微卫星位点tSb-SSR12与眼斑水龟性别显著相关，并进一步扩大雌雄群体样本量对该位点与性别的相关性进行了验证，在64个雌雄样本中扩增的结果表明，微卫星位点tSb-SSR12与眼斑水龟性别显著相关。说明本专利技术筛选出的tSb-SSR12微卫星标记的特异性引物不仅能够用于眼斑水龟的遗传多样性水平评估、种群遗传结构分析、亲缘关系鉴定等工作，而且可用于雌雄眼斑水龟遗传差异分析、幼体性别鉴定等工作。本专利技术的第二个目的是提供鉴别眼斑水龟性别的方法，其是将待测眼斑水龟进行基因组DNA提取，然后以上述眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物进行PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测和相关性分析，鉴别待测眼斑水龟的性别。所述的PCR扩增，其反应体系为：所述的PCR扩增，其反应程序为：PCR反应程序本专利技术的第三个目的是提供一种鉴别眼斑水龟性别的试剂盒，其含有上述眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物和PCR反应试剂。本专利技术发现了眼斑水龟微卫星位点tSb-SSR12的新用途，该位点与眼斑水龟性别呈显著相关(P<0.05)，因此能够应用于眼斑水龟雌雄遗传差异分析、成体和幼体性别鉴定等工作。附图说明图1为荧光标记的眼斑水龟微卫星位点tSb-SSR12扩增雌雄眼斑水龟基因组DNA的毛细管电泳检测部分峰图，其中12-A02、12-B02为雄性个体扩增结果峰图，12-A04、12-B04为雌性个体扩增结果峰图。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1一、样本采集：试验用眼斑水龟样本采自广东省，其中用于7个微卫星位点扩增的30只样本采自广东惠州，用于微卫星位点tSb-SSR12再次扩增验证的34只样本包括广东四会25只、广东惠州8只、广东从化1只，分别使用无菌的口腔拭子在口腔里适当用力擦拭，将拭子放入含有样品保护剂的无菌离心管中，低温冷冻(-20℃～-80℃)保存，直至开始提取DNA。二、DNA提取(DNA提取所用到的试剂原液或粉末均购自生工生物工程(上海)股份有限公司)：1)样品的预处理：使用无菌的剪刀，将口腔拭子的表面层(含口腔脱落细胞)剥离，然后将剥离部分转移至一个新的1.5mL的无菌离心管中。添加PBS0.7mL，震荡混匀，12000r/min离心5分钟，弃上清。2)样品的裂解：加入400μL的拭子裂解液和15μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀后，放至65℃的水浴中消化2小时，每30分钟上下颠倒混匀1次。3)离心弃沉淀：12000r/min离心5分钟，转移上清至一个新的1.5mL的离心管。4)第一次提取：加入200μL(约二分之一体积)的5mol/L的NaCl，上下颠倒混匀5分钟，12000r/min离心5分钟，转移上清至一个新的1.5mL的离心管。5)第二次提取：加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(氯仿：异戊醇体积比为24:1)，上下颠倒混匀5分钟，12000r/min离心5分钟，转移上清至一个新的1.5mL的离心管。6)DNA的沉淀：加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀2分钟，放至-20℃静置30分钟，然后12000r/min离心10分钟，弃上清。7)DNA的洗涤：加入700μL的75％的冰乙醇，上下颠倒混匀2分钟，然后12000r/min离心10分钟，弃上清。8)DNA的干燥：将含DNA的离心管口朝下放在室温晾干。9)DNA的溶解：将每份样品中加入50μL的ddH2O，震荡溶解后，-80℃冻存，由此得到眼斑水龟基因组DNA。三、荧光标记引物合成及PCR扩增：合成带荧光标记基团的7个微卫星位点特异性引物，以雌雄各15个样本基因组DNA为模板，分别进行PCR扩增，位点特异性引物信息见表1，PCR反应体系见表2，PCR扩增程序见表3。表1.微卫星位点特异性引物信息表2.PCR反应体系表3.PCR反应程序四、毛细管电泳检测及结果分析：PCR扩增产物以锡纸密封，4℃运送至生工生物工程(上海)股份有限公司，进行毛细管电泳检测，检测结果用GeneMapperv3.2软件分析，以LIZ500为内标标定片段大小，对各个微卫星位点的扩增结果进行基因分型。以英文字母A～Z代表不同的等位基因，以AB、AC、BB等记录表示每个个体的基因型，按照POPGENE32软件的格式进行整理。用POPGENE32软件计算每个微卫星位点与眼斑水龟雌雄群体的相关性，进行卡方检验，以P<0.05为显著相关，P<0.01为极显著相关。经检验，微卫星位点tSb-SSR12与眼斑水龟性别极显著相关，其余6个位点与性别的相关性不显著。检验结果见表4。表4眼斑水龟雌雄群体性别相关微卫星标记检验结果五、性别相关位点tSb-SSR12的验证：增加雌雄个体样本量，对位点tSb-SSR12进行进一步验证。其中雌性增加21个样本，雄性增加13个样本，共计增加34个样本。按照步骤一、二中所述的方法对34个新增样本进行样本采集和基因组提取；按照步骤三中所述的PCR扩增体系和反应程序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物，其特征在于，包括/n微卫星位点tSb-SSR12特异性引物：F:TCTGGAGTCCATAGCTGC/n R:CTCACATTGACGAAAGGC。/n

【技术特征摘要】
1.一种眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物，其特征在于，包括
微卫星位点tSb-SSR12特异性引物：F:TCTGGAGTCCATAGCTGC
R:CTCACATTGACGAAAGGC。


2.一种鉴别眼斑水龟性别的方法，其特征在于，是将待测眼斑水龟进行基因组DNA提取，然后以权利要求1所述的眼斑水龟性别相关微卫星标记的特异性引物进行PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测和数据分析，鉴别待...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟业，
申请(专利权)人：广东省生物资源应用研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44