一种活性提高的肌酸脒基水解酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种活性提高的肌酸脒基水解酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明专利技术利用无系统发育偏见的共识方法对肌酸脒基水解酶序列进行分析，筛选得到活性显著提升的单点突变体并对其进行定点突变，获得对活性提高的突变酶D17V/K351E，T199S/K351E，D17V/T199S/K351E，D17V/T117P/K351E与野生型相比，这些突变酶的活力提升2倍左右。

【技术实现步骤摘要】
一种活性提高的肌酸脒基水解酶突变体
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种活性提高的肌酸脒基水解酶突变体。
技术介绍
肌酸脒基水解酶是酶促方法检测肌酐含量的必不可少的酶，它能够将肌酸转化成肌氨酸和尿素，进一步生成能够进行化学检测的过氧化氢。该酶主要来源于微生物，目前已被广泛应用于医疗诊断、有机合成等行业。肌酸脒基水解酶用于工业上测定肌酐含量，除此之外，也经常被用于临床分析诊断血清和尿液中肌酐含量和与健康机体中肌酐含量不同的肾脏疾病。肌酐是应用人体磷酸肌酸代谢的最终产物，经肾脏过滤后，再从血液中进入尿液，排出体外。一般来说，血清肌酐的正常范围在35～150μm之间，但当肾功能或肌肉功能出现问题时，肌酐含量会上升至1000μm，血液和尿液中的肌酐含量可以反映肾脏的排泄功能。目前为止检测肌酐含量最常用的是Jaffe化学检测方法和酶比色法。相比之下，由于酶促法检较高的灵敏度和选择性等特点，日益受到关注。在酶促检测方法中，待测样品通过肌肝水解酶，肌酸脒基水解酶和肌氨酸氧化酶连续转化，最终肌酐被降解为过氧化氢，通过在辣根过氧化物酶催化下的比色反应来确定过氧化氢的浓度，从而达到检测肌酐含量的目的。因此，为了更好的将肌酸脒基水解酶应用于临床肌酐检测，本专利技术采用定点突变，获得了活性显著提升的突变酶，解决了现有的肌酸脒基水解酶活力较差的缺陷不能满足应用于试剂的需求，为拓宽肌酸脒基水解酶的工业应用奠定了基础。
技术实现思路
为了更好的将肌酸脒基水解酶应用于临床肌酐检测，本专利技术采用定点突变，获得了活性显著提升的突变酶，解决了现有的肌酸脒基水解酶活力较差的缺陷不能满足应用于试剂的需求，为拓宽肌酸脒基水解酶的工业应用奠定了基础。本专利技术第一个目的是提供一种肌酸脒基水解酶的突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体为如下(a1)或(a2)：(a1)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQIDNO.1的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQIDNO.1示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQIDNO.1示的蛋白表现出至少92％同源性的衍生蛋白。优选地，该肌酸脒基水解酶突变体，SEQIDNO.1示的氨基酸序列的突变位点包括以下至少一个：第17位、第58位、第117位、第199位及第351位。进一步优选地，该肌酸脒基水解酶突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体包括在SEQIDNO.1示的氨基酸序列上D17V、G58D、T117P、T199S、K351E中任一单点突变位点的单点突变体。进一步优选地，该肌酸脒基水解酶突变体，所述肌酸脒基水解酶突变体包括在SEQIDNO.1所示的氨基酸序列上D17V/G58D、D17V/T117P、D17V/K351E、D17V/T199S、T199S/K351E、D17V/T199S/K351E、D17V/T117P/T199S、D17V/T117P/K351E。本专利技术的第二个目的是提供编码肌酸脒基水解酶突变体的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因含有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。本专利技术的第三个目的是提供含有所述基因的载体。本专利技术的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞包括大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌。本专利技术的第五个目的是提供一种提高肌酸脒基水解酶活性的方法，包括以下步骤：1、在NCBI数据库中搜索SEQIDNO.1的氨基酸序列，删除重复出现的相同序列，选取与SEQIDNO.1氨基酸序列一致性大于50％的氨基酸序列；2、然后通过ClustalX2.1软件进行多序列比对，将剩余氨基酸质序列整理成fasta.文件导入到MEGA7.0软件，利用其Phylogenetic模块中NJ算法构建系统发育树；3、根据系统发育树的分支距离引入权重，通过python脚本计算consensussequence，结合同源建模结构筛选出活性相关的突变位点为D17V,G58D,T117P,T199S,K351E。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体是将GenBank登录号为BAA88830.1的肌酸脒基水解酶的第6、17、20、52、58、73、108、166、351、33、59、109、162、117、165、199、251、349、362、340和331位氨基酸进行突变。本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的肌酸脒基水解酶突变体包括单点突变体和组合突变体，与野生型肌酸脒基水解酶(BAA88830.1)相比，其单点突变体和组合突变体在55℃及57℃下活力均有提升，最佳突变体活力大约是野生型肌酸脒基水解酶(BAA88830.1)的1.6倍。基于此，本专利技术所提供的肌酸脒基水解酶突变体的活性更好，通过本专利技术所提供的构建方法得到的肌酸脒基水解酶突变体在较高的温度下催化肌酸生成肌氨酸和尿素时表现出优良的催化活性。2.本专利技术构建的肌酸脒基水解酶(BAA88830.1)基因工程菌可以高效表达肌酸脒基水解酶突变体,且培养条件简单，培养周期短，表达产物纯化方便等优点。具体实施方式突变体命名方式：采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如G58D，表示位置58的氨基酸由亲本肌酸脒基水解酶的Glu替换成Asp，位置的编号对应于亲本肌酸脒基水解酶的氨基酸序列。具体实施方式突变体命名方式：采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如L6P，表示位置6的氨基酸由亲本肌酸脒基水解酶的Leu替换成Pro，位置的编号对应于亲本肌酸脒基水解酶的氨基酸序列。实施例1：单点肌酸脒基水解酶(BAA88830.1)突变体的构建野生型肌酸脒基水解酶质粒Pany1-CR-AF-WT由实验室保藏，通过全质粒PCR方法构建单点肌酸脒基水解酶突变体。细节如下：以Pany1-CR-AF-WT为模板，各突变位点的上下游引物列于表1中，分别以“突变位点取代氨基酸”的格式命名。使用高保真DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase试剂盒，进行一轮进行PCR扩增以期获得含有突变体的基因重组质粒。反应体系如表2所示，PCR条件：预变性：95℃4min；变性：98℃10s；退火：55℃5s；延伸：72℃6min；循环25次；充分延伸：72℃10min。表2引物表使用高保真DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase试剂盒，进行一轮进行PCR扩增以期获得含有突变体的基因重组质粒。反应体系如表2所示，PCR条件：预变性：95℃4min；变性：98℃10s；退火：55℃5s；延伸：72℃6min；循环25次；充分延伸：72℃10min。表2第一轮PCR扩增的反应体系实施例2：多点肌酸脒基水解酶(BA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肌酸脒基水解酶突变体，其特征在于，所述肌酸脒基水解酶突变体为如下(a1)或(a2)：/n(a1)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQID NO.1所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；/n(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQ ID NO.1所示的蛋白表现出至少92％同源性的衍生蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种肌酸脒基水解酶突变体，其特征在于，所述肌酸脒基水解酶突变体为如下(a1)或(a2)：
(a1)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQIDNO.1所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；
(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQIDNO.1所示的蛋白表现出至少92％同源性的衍生蛋白。


2.如权利要求1所述的肌酸脒基水解酶突变体，其特征在于，SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的突变位点包括以下至少一个：第17位、第58位、第117位、第199位及第351位。


3.如权利要求2所述的肌酸脒基水解酶突变体，其特征在于，所述肌酸脒基水解酶突变体包括在SEQIDNO.1所示的氨基酸序列上D17V、G58D、T117P、T199S、K351E中任一单点突变位点的单点突变体。


4.如权利要求3所述的肌酸脒基水解酶突变体，其特征在于，所述肌酸脒基水解酶突变体包括在SEQIDNO.1所示的氨基酸序列上上D17V/G58D、D17V/T117P、D17V/K351E、D17V/T199S、T199S/K351E、D17V/T199S/K351E、D17V/T117P/T199S、D17V/T117P/K351E中任一组合突变位点的组合突变体。


5.一种编码如权利要求1-4任一所述的肌酸脒基水解酶突变体的基因。

【专利技术属性】
技术研发人员：杨广宇，白雪，罗漫杰，宫安，王梁，
申请(专利权)人：上海瀚诺威生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31