一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用，本发明专利技术使用大肠杆菌表达含嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)来源的嗜热菌蛋白酶Npr的突变体，突变体Npr‑115M2的全细胞催化体系酶活为17U/mL，较突变前提高了55％。后续利用大肠杆菌BL21表达Npr‑115M2，并进行全细胞转化合成阿斯巴甜前体苄氧羰基阿斯巴甜的温度优化，底物苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯在反应温度为34℃时的转化率为70％，最终得到的阿斯巴甜产率在95％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用
本专利技术涉及一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程

技术介绍
阿斯巴甜的化学名称为L-天冬酰胺-L-苯丙氨酸甲脂，简称为APM，是一种新型高效的甜味剂。阿斯巴甜的甜味大约是蔗糖200倍，热量仅为蔗糖的1/200，具有清凉感，和其他的甜味剂比较而言具有味质佳、稳定性好等优点。阿斯巴甜不仅在甜味方面具有优势，也适合添加到特殊人群食品当中。由于阿斯巴甜是由天冬氨酸和苯丙氨酸组成的二肽化合物，进入人体后可以分解为两种氨基酸，可以供人体合成蛋白质使用。同时，因为阿斯巴甜的甜度高，用量小，所以提供的热量很低，可以用于减肥健身等健康食品的研发。此外，阿斯巴甜在人体内的代谢过程不涉及胰岛素，不影响血糖水平，可供糖尿病人食用。另一方面，阿斯巴甜在口腔内不会被链球菌利用产生酸，故不会产生龋齿，所以可应用于儿童安全食品。实现阿斯巴甜的高效生产，对降低食品生产成本，提高食品品质和安全，满足特殊人群的甜味需求有着重要的作用。阿斯巴甜由天冬氨酸和苯丙氨酸形成二肽后甲酯化形成，如果反应过程中两种氨基酸不带保护基，则会发生自身酰化或互相酰化形成六种二肽，副产物多。目前报道的阿斯巴甜主要通过化学法、酶法两种方法来合成。化学合成法主要分为酸酐法和内酯法，酸酐法合成阿斯巴甜反应中会产生β-异构体，回收难度大收率低，内酯法合成过程需要剧毒原料，因此限制了其工业化应用。酶合成法是使用蛋白酶将两种氨基酸进行缩合，目前的研究一般采用嗜热蛋白酶或者嗜热蛋白酶与化学法结合的方法生产阿斯巴甜，日本专利JP60118190在使用嗜热蛋白酶合成阿斯巴甜的过程中，反应体系采用双相法高效的合成阿斯巴甜前体，可以将生成的中间体直接萃取到有机相中，因此酶促反应不受到抑制，过剩原料存在溶液中可循环使用，产率达到95％以上。然而这些研究仍然处于实验室阶段，产物在两相中的分配比例难以控制，底物浓度低，高浓度底物和有机相对酶抑制程度强，难以大规模应用。目前我国最有实力的阿斯巴甜生产厂家武进牛塘化学厂和浙江亚美生化股份有限公司均通过化学法合成。化学合成法合成过程中需要将氨基酸加上保护碱基，再将保护碱基去除，合成路线普遍较长，专一性较差，收率偏低，该过程污染严重、反应副产物多、分离纯化价格高。酶法合成过程需要对酶进行纯化，而利用全细胞转化法合成阿斯巴甜可以避免酶的纯化过程，改变目前已有的阿斯巴甜的生产现状，对低生产成本、控制环境污染，促进阿斯巴甜价格竞争力，有着重要的作用。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术通过对嗜热菌蛋白酶的关键位点进行定点饱和突变，进一步提高了全细胞催化体系的酶活。随后对反应温度进行了优化，进一步提高了阿斯巴甜的转化效率，可以降低生产成本、控制环境污染，促进阿斯巴甜价格竞争力。本专利技术的第一个目的是提供一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌异源表达了氨基酸序列如SEQIDNO.4所示的嗜热菌蛋白酶Npr突变体。进一步地，所述的嗜热菌蛋白酶Npr突变体的氨基酸序列是将SEQIDNO.1所示的亲本序列中，成熟序列的第115位色氨酸突变为甘氨酸。进一步地，所述的重组大肠杆菌是以pET系列载体表达嗜热菌蛋白酶Npr。进一步地，所述的重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109或大肠杆菌W3110。本专利技术的第二个目的是提供所述的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：(1)将嗜热菌蛋白酶编码基因序列与载体连接，构建表达载体；(2)将步骤(1)构建得到的表达载体转入大肠杆菌宿主中，得到表达嗜热菌蛋白酶的重组大肠杆菌。本专利技术的第三个目的是提供所述的重组大肠杆菌在全细胞转化合成阿斯巴甜中的应用。进一步地，所述的应用具体是以重组大肠杆菌作为全细胞催化剂，催化苯丙氨酸甲酯和苄氧羰基天冬氨酸反应生成苄氧羰基阿斯巴甜。进一步地，所述的全细胞催化剂是将重组大肠杆菌在发酵培养基中培养收集得到的菌体，采用缓冲液配制成的细胞悬液；其中，所述的培养是在400～600rpm，25～30℃，通气量为0.8～1.2vvm条件下，培养至菌体OD600为0.5～0.7时，添加0.3～0.5mM的IPTG诱导目的基因表达。进一步地，所述的催化的体系为300～350mM苯丙氨酸甲酯，70～90mM苄氧羰基天冬氨酸和20～30g·L-1全细胞催化剂，催化的条件为31～37℃，200～250rpm，反应时间为20～30h。进一步地，所述的发酵培养基为酵母粉20～25g·L-1，胰蛋白胨10～15g·L-1，甘油3～7mL，15～20mM磷酸氢二钾和70～75mM磷酸二氢钾混合溶液80～120mL。本专利技术的有益效果：本专利技术使用大肠杆菌表达含嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusthermoproteolyticus)来源的嗜热菌蛋白酶Npr的突变体，突变体Npr-115M2的全细胞催化体系酶活为17U/mL，较突变前提高了55％。后续利用大肠杆菌BL21表达Npr-115M2，并进行全细胞转化合成阿斯巴甜前体苄氧羰基阿斯巴甜的温度优化，底物苄氧羰基天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯在反应温度为34℃时的转化率为70％，最终得到的阿斯巴甜产率在95％以上。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。培养基：反应底物：含2％酪蛋白的Tris-HCl缓冲液(pH为8)。10％三氯乙酸溶液(TCA)：称取10gTCA，溶解于100mL水中。大肠杆菌种子培养基：酵母粉0.5g·L-1，胰蛋白胨1g·L-1，氯化钠1g·L-1。大肠杆菌发酵培养基：酵母粉24g·L-1，胰蛋白胨12g·L-1，甘油5mL，17mM磷酸氢二钾和72mM磷酸二氢钾混合溶液100mL。涉及的检测方法：嗜热菌蛋白酶酶活检测方法：以含2％酪蛋白的Tris-HCl缓冲液作为反应底物，每300μL底物加入500μL大肠杆菌细胞悬浮液，40℃反应10min。随后用500μLTCA缓冲液终止反应，将反应体系在4℃条件下静置20min，8000×g离心10min，吸取上清液在280nm波长下测定吸光值。表1引物序列引物名称DNA序列(SEQIDNO.5～11)npFCTCGAGATGAAAATGAAAATGAAATTAGCATCGTTTGGTnpRTCCGAATTCTTATTTCACCCCTACCGCATCAAAGGnpr-1FATAACAGGAACATCAACTGTCGGAGTnpr-1RTTGCGAACCGTTNNNAAATGCGTTATTATAnpr-2FGCAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌异源表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的嗜热菌蛋白酶Npr突变体。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达嗜热菌蛋白酶突变体的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌异源表达了氨基酸序列如SEQIDNO.4所示的嗜热菌蛋白酶Npr突变体。


2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的嗜热菌蛋白酶Npr突变体的氨基酸序列是将SEQIDNO.1所示的亲本序列中，成熟序列的第115位色氨酸突变为甘氨酸。


3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是以pET系列载体表达嗜热菌蛋白酶Npr。


4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌的宿主为大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109或大肠杆菌W3110。


5.一种权利要求1～4任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将嗜热菌蛋白酶编码基因序列与载体连接，构建表达载体；
(2)将步骤(1)构建得到的表达载体转入大肠杆菌宿主中，得到表达嗜热菌蛋白酶的重组大肠杆菌。


6.一种权利要求1～4任一项所述的重组大肠杆菌在全细胞转...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，徐堃，陈坚，堵国成，李江华，房峻，吕雪芹，陈泰驰，
申请(专利权)人：江南大学，江苏汉光生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32