诺丽果均一多糖提取分离方法和应用技术

诺丽果均一多糖提取分离方法和应用，本发明专利技术涉及多糖的提取分离及应用领域。本发明专利技术要解决现有诺丽果多糖的提取方法存在成分易被破坏，耗时长，提取率低，并且诺丽果多糖药理作用不明确的技术问题。方法：制备诺丽果粗粉；闪式提取，浓缩，醇沉，浓缩，干燥，获得诺丽果粗多糖；脱蛋白处理，脱色；采用DEAE‑52纤维柱洗脱，采用Sephadex G‑75凝胶柱层析，获得五种诺丽果均一多糖。本发明专利技术对诺丽果多糖提取方法进行了改进与优化，利用闪式提取方法能最大限度保留植物有效成分，显著缩短提取时间、极大地提高了提取效率。经验证诺丽果均一多糖对人肝癌细胞HepG2具有抑制作用。本发明专利技术提取的诺丽果均一多糖作为抑制人肝癌细胞的生物活性成分应用于制备抗肿瘤药物。

【技术实现步骤摘要】
诺丽果均一多糖提取分离方法和应用
本专利技术涉及多糖的提取分离及应用领域。
技术介绍
诺丽(Noni)，学名Morindacitrifolia，又称海滨木巴戟、海巴戟天、诺尼，为茜草科巴戟天属灌木至小乔木，是一种主要生长于热带和亚热带的四季绿色的药用植物，已有2000余年的历史。诺丽果的果实未成熟时为绿色，成熟后变为黄色，最终为棕色。诺丽果的药用特性，让其在我国，波利尼西亚和夏威夷都广受欢迎。但由于诺丽果的植物细胞壁比较坚固，所以提取植物多糖最主要的工作是对细胞壁进行破碎。因此现有方法提取诺丽果多糖往往比较耗时，并且提取率低，仅在6％-8％之间，提取方法有待改进提高。同时，有越来越多的国内外学者对诺丽进行了深入的研究，但它的许多药理研究都有些浅显，起作用的具体机制还有待于进一步研究。还需要进一步研究单一成分，特别是一些新的化合物和药理作用，可以为新的药物开发提供依据。随着诺丽的化学成分更深入的研究和药理活性，其保健和药用功能的开发将有更广阔的空间，这将占据药用植物和健康产品在世界领域的一个越来越重要的地位。然而由于单糖的种类繁多，连接方式与分支情况千变万化，给人们揭示其庞大的空间构象带来了巨大的障碍，同时也限制了多糖类药物的应用。
技术实现思路
本专利技术要解决现有诺丽果多糖的提取方法存在成分易被破坏，耗时长，提取率低，并且诺丽果多糖药理作用不明确的技术问题，而提供诺丽果均一多糖及其提取分离方法和应用。诺丽果均一多糖提取分离方法，具体按以下步骤进行：一、将诺丽果干表面去除杂质，粉碎，过筛，获得诺丽果粗粉；二、将诺丽果粗粉放入蒸馏水中浸泡，然后施加电压进行闪式提取，控制电压为100～140V，获得提取液；三、将提取液冷却至室温，然后过滤获得滤液，采用旋转蒸发仪将滤液进行浓缩，获得浓缩液；四、将乙醇溶液加入到浓缩液中，控制温度为4～5℃醇沉24～25h，然后进行离心处理，获得沉淀物；五、将沉淀物溶入蒸馏水中，再进行离心处理，取上清液进行浓缩，干燥，获得诺丽果粗多糖；六、采用Sevag法对诺丽果粗多糖进行脱蛋白处理，获得脱蛋白的诺丽果多糖；七、将脱蛋白的诺丽果多糖配制多糖溶液，调节pH值至7，加入过氧化氢溶液，在温度为50～52℃的条件下脱色1～1.2h，然后放入透析袋中蒸馏水透析24～25h，再加入无水乙醇，调节无水乙醇体积分数至75％，静置24～25h后离心干燥，得到脱色的诺丽果多糖；八、将脱色后的诺丽果多糖加入到蒸馏水中完全溶解，离心处理后将上清液加入到DEAE-52纤维柱中静置12～13h，上样量为50mg/10mL，然后采用浓度为0.2mol/L的NaCl溶液进行洗脱，控制流速为1mL/min，用自动部分收集器收集洗脱液，每2min收集1管，每管2mL，采用苯酚-硫酸法对洗脱液检测吸光度值，收集主要吸收峰液体；再用水透析72～74h，蒸馏水透析48～50h后冷冻干燥，获得多糖初产物；九、将多糖初产物加入到蒸馏水中完全溶解，离心处理后将上清液加入到SephadexG-75凝胶柱中静置12～13h，采用蒸馏水作为洗脱剂进行柱层析，控制流速为1mL/min，每5min收集1管层析液，每管2mL，采用苯酚-硫酸法对层析液检测吸光度值，收集主要吸收峰液体；然后透析48～50h后冷冻干燥，获得五种诺丽果均一多糖，完成诺丽果均一多糖提取分离方法。步骤九获得五种诺丽果均一多糖，分别命名为NONI-A1、NONI-A2、NONI-B、NONI-C、NONI-D2，其中的一种诺丽果均一多糖NONI-C的结构式为本专利技术的有益效果是：本专利技术对诺丽果多糖提取方法进行了改进与优化，采用最佳工艺条件，尤其本专利技术利用闪式提取方法能最大限度保留植物有效成分，显著缩短提取时间、极大地提高了提取效率。这将为生产企业带来巨大的经济效益，为诺丽果多糖产品带来更高的附加值。诺丽果多糖的结构解析为后续揭示构效关系打下基础，为功能性产品在多糖选择方面提供参考，同时也将改变诺丽果现有产品的市场格局，为诺丽果产业化发展奠基铺路。另外本方法通过对诺丽果多糖的提取、分离、纯化得到5种诺丽果均一多糖，并揭示了诺丽果多糖的单糖组成以及空间结构，为诺丽果多糖的开发利用提供基础数据。同时本专利技术以肝癌细胞HepG2为研究对象，采用MTT法检测不同浓度的诺丽果均一多糖对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用，为诺丽果均一多糖在抗肿瘤药物中应用提供了研究基础。经实验验证采用本专利技术方法提取的诺丽果粗多糖中诺丽果多糖含量为45.07％，提取率为16.08％；另外检测诺丽果均一多糖对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用时，诺丽果均一多糖对人肝癌细胞HepG2作用72h后生长抑制率可达到70.65％，随着诺丽果均一多糖给药浓度增大，生长抑制率逐渐增强，呈剂量依赖关系，经计算，诺丽果均一多糖对人肝癌细胞HepG2作用72h后的半数抑制浓度(IC50)为38μg·mL-1，证实诺丽果均一多糖对人肝癌细胞HepG2具有抑制作用。本专利技术提取的诺丽果均一多糖作为抑制人肝癌细胞的生物活性成分应用于制备抗肿瘤药物。附图说明图1为实施例一获得的诺丽果均一多糖NONI-C的紫外光谱图；图2为实施例一获得的诺丽果均一多糖NONI-C的红外光谱图；图3为实施例一获得的诺丽果均一多糖NONI-C的衍生物液相色谱图；图4为实施例一获得的诺丽果均一多糖NONI-C刚果红实验在不同NaOH浓度下的紫外-可见分光扫描图；图5为实施例一获得的诺丽果均一多糖NONI-C的XPS检测谱图；图6为实施例一获得的诺丽果均一多糖NONI-C放大8470倍的扫描电镜图；图7为实施例一获得的诺丽果均一多糖NONI-C放大5万倍的扫描电镜图；图8为实施例一获得的诺丽果均一多糖NONI-C放大10万倍的扫描电镜图；图9为NONI-C对人胃癌SGC-7901细胞CDK1表达水平影响图；图10为NONI-C对人胃癌SGC-7901细胞CyclinB1表达水平影响图；图11为NONI-C对人胃癌SGC-7901细胞CDC25c表达水平影响图；图12为NONI-C对人胃癌SGC-7901细胞FoxM1表达水平影响图；图13为NONI-C对人胃癌SGC-7901细胞BubR1表达水平影响图。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式诺丽果均一多糖提取分离方法，具体按以下步骤进行：一、将诺丽果干表面去除杂质，粉碎，过筛，获得诺丽果粗粉；二、将诺丽果粗粉放入蒸馏水中浸泡，然后施加电压进行闪式提取，控制电压为100～140V，获得提取液；三、将提取液冷却至室温，然后过滤获得滤液，采用旋转蒸发仪将滤液进行浓缩，获得浓缩液；四、将乙醇溶液加入到浓缩液中，控制温度为4～5℃醇沉24～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.诺丽果均一多糖提取分离方法，其特征在于该方法具体按以下步骤进行：/n一、将诺丽果干表面去除杂质，粉碎，过筛，获得诺丽果粗粉；/n二、将诺丽果粗粉放入蒸馏水中浸泡，然后施加电压进行闪式提取，控制电压为100～140V，获得提取液；/n三、将提取液冷却至室温，然后过滤获得滤液，采用旋转蒸发仪将滤液进行浓缩，获得浓缩液；/n四、将乙醇溶液加入到浓缩液中，控制温度为4～5℃醇沉24～25h，然后进行离心处理，获得沉淀物；/n五、将沉淀物溶入蒸馏水中，再进行离心处理，取上清液进行浓缩，干燥，获得诺丽果粗多糖；/n六、采用Sevag法对诺丽果粗多糖进行脱蛋白处理，获得脱蛋白的诺丽果多糖；/n七、将脱蛋白的诺丽果多糖配制多糖溶液，调节pH值至7，加入过氧化氢溶液，在温度为50～52℃的条件下脱色1～1.2h，然后放入透析袋中蒸馏水透析24～25h，再加入无水乙醇，调节无水乙醇体积分数至75％，静置24～25h后离心干燥，得到脱色的诺丽果多糖；/n八、将脱色后的诺丽果多糖加入到蒸馏水中完全溶解，离心处理后将上清液加入到DEAE-52纤维柱中静置12～13h，上样量为50mg/10mL，然后采用浓度为0.2mol/L的NaCl溶液进行洗脱，控制流速为1mL/min，用自动部分收集器收集洗脱液，每2min收集1管，每管2mL，采用苯酚-硫酸法对洗脱液检测吸光度值，收集主要吸收峰液体；再用水透析72～74h，蒸馏水透析48～50h后冷冻干燥，获得多糖初产物；/n九、将多糖初产物加入到蒸馏水中完全溶解，离心处理后将上清液加入到Sephadex G-75凝胶柱中静置12～13h，采用蒸馏水作为洗脱剂进行柱层析，控制流速为1mL/min，每5min收集1管层析液，每管2mL，采用苯酚-硫酸法对层析液检测吸光度值，收集主要吸收峰液体；然后透析48～50h后冷冻干燥，获得五种诺丽果均一多糖，完成诺丽果均一多糖提取分离方法。/n...

【技术特征摘要】
1.诺丽果均一多糖提取分离方法，其特征在于该方法具体按以下步骤进行：
一、将诺丽果干表面去除杂质，粉碎，过筛，获得诺丽果粗粉；
二、将诺丽果粗粉放入蒸馏水中浸泡，然后施加电压进行闪式提取，控制电压为100～140V，获得提取液；
三、将提取液冷却至室温，然后过滤获得滤液，采用旋转蒸发仪将滤液进行浓缩，获得浓缩液；
四、将乙醇溶液加入到浓缩液中，控制温度为4～5℃醇沉24～25h，然后进行离心处理，获得沉淀物；
五、将沉淀物溶入蒸馏水中，再进行离心处理，取上清液进行浓缩，干燥，获得诺丽果粗多糖；
六、采用Sevag法对诺丽果粗多糖进行脱蛋白处理，获得脱蛋白的诺丽果多糖；
七、将脱蛋白的诺丽果多糖配制多糖溶液，调节pH值至7，加入过氧化氢溶液，在温度为50～52℃的条件下脱色1～1.2h，然后放入透析袋中蒸馏水透析24～25h，再加入无水乙醇，调节无水乙醇体积分数至75％，静置24～25h后离心干燥，得到脱色的诺丽果多糖；
八、将脱色后的诺丽果多糖加入到蒸馏水中完全溶解，离心处理后将上清液加入到DEAE-52纤维柱中静置12～13h，上样量为50mg/10mL，然后采用浓度为0.2mol/L的NaCl溶液进行洗脱，控制流速为1mL/min，用自动部分收集器收集洗脱液，每2min收集1管，每管2mL，采用苯酚-硫酸法对洗脱液检测吸光度值，收集主要吸收峰液体；再用水透析72～74h，蒸馏水透析48～50h后冷冻干燥，获得多糖初产物；
九、将多糖初产物加入到蒸馏水中完全溶解，离心处理后将上清液加入到SephadexG-75凝胶柱中静置12～13h，采用蒸馏水作为洗脱剂进行柱层析，控制流速为1mL/min，每5min收集1管层析液，每管2mL，采用苯酚-硫酸法对层析液检测吸光度值，收集主要吸收峰液体；然后透析48～50h后冷冻干燥，获得五种诺丽果均一多糖，完...

【专利技术属性】
技术研发人员：于淼，王冰，綦峥，杜洋，
申请(专利权)人：于淼，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23