真菌伴侣蛋白制造技术

本发明专利技术涉及真菌宿主细胞，其包含含有与编码分子伴侣的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的核酸构建体、含有编码分子伴侣的多核苷酸的核酸构建体，并且涉及产生目的多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】真菌伴侣蛋白对序列表的引用本申请含有计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用并入本文。
本专利技术涉及真菌宿主细胞，其包含含有与编码分子伴侣的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的核酸构建体、含有编码分子伴侣的多核苷酸的核酸构建体，并且涉及产生目的多肽的方法。
技术介绍
在工业生物技术中，持续需要提高生产收得率，从而在酶和其他工业相关蛋白质的生产中提高利润率。迄今为止，成功的策略是采用生产宿主细胞，这些宿主细胞过表达编码靶蛋白的基因。有进行此操作的已知且容易获得的方法，如通过使用多拷贝质粒增加基因表达或通过修饰其控制序列(例如通过使用强启动子或多个启动子)来增强基因的活性。通过这种方式已经实现了分泌型蛋白的合成的显著改善，直至由于分泌机制的瓶颈而使基因表达的另外的改善不再带来进一步好处的水平。因此，提高生产宿主细胞的分泌能力的方法是非常有必要的，因为这样的改进将与众所周知的基因过表达的概念并行工作，并导致总生产收得率的累加作用或甚至协同作用。分子伴侣是协助其他蛋白折叠的蛋白。生产宿主细胞中一种或多种分子伴侣的过度表达可以使给定的靶蛋白的折叠增强，这反过来又可能导致正确折叠的蛋白质分泌增强，从而提高生产收得率。分子伴侣的过度表达已被用于优化原核宿主细胞(参见，例如，WO1994/019471；Westers等人Bacillussubtilisascellfactoryforpharmaceuticalproteins:abiotechnologicalapproachtooptimizethehostorganism[作为药用蛋白质的细胞工厂的枯草芽孢杆菌：一种优化宿主生物的生物技术方法]Biochem.Biophys.Acta.[生物化学与生物物理学报],第1694卷,第299-310页,2004)。还描述了以下真菌生物中的各种分子伴侣：重点是酵母菌(参见，例如Verghese等人BiologyoftheHeatShockResponseandProteinChaperones:BuddingYeast(Saccharomycescerevisiae)asaModelSystem[热休克反应和蛋白质伴侣的生物学：芽殖酵母(酿酒酵母)作为模型系统].Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学综述],第76卷,第115-158页,2012)，以及较小程度地，丝状真菌(参见，例如，Conesa等人Thesecretionpathwayinfilamentousfungi:abiotechnologicalview[丝状真菌的分泌途径：生物技术观点].FungalGeneticsandBiology[真菌遗传学与生物学],第33卷,第155-171页,2001)。在真菌宿主细胞中，大多数胞外蛋白是通过常规蛋白分泌(CPS)途径分泌的，该途径涉及囊泡介导的从内质网(ER)穿过高尔基体到细胞膜的转运。但是，研究还报道了独立于经典ER-高尔基体途径以外分泌的胞外蛋白。该过程称为非常规蛋白分泌(UPS)途径，并且包括几种不同的囊泡和非囊泡转运途径。UPS途径尚未完全阐明，但最近在丝状真菌中描述了通过UPS途径分泌的蛋白质的证据(参见，例如，Burgraaf等人TheunconventionalsecretionofPepNisindependentofafunctionalautophagymachineryinthefilamentousfungusA.niger[PepN的非常规分泌独立于丝状真菌黑曲霉中的功能性自噬机制].FEMSMicrobiologyLett.[FEMS微生物学快报],第363卷,第1-7页,2016年；Kwon等人,Analysisofanacyl-CoAbidingproteininA.oryzaethatundergoesunconventionalsecretion[经历非常规分泌的米曲霉中的酰基辅酶A结合蛋白分析].Biochem.Biophys.Res.Com.[生物化学和生物物理研究通讯],第493卷,481-486页,2017)。取决于靶蛋白，利用这些途径中的一种或两种途径来优化真菌宿主细胞中的蛋白质分泌可能是有益的。因此，由于本领域对提高生产收得率的持续需求，鉴定能够通过CPS途径和/或UPS途径协助蛋白质分泌的其他分子伴侣是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术提供了利用真菌分子伴侣Ssa2、Sse2和Hsc82来改善工业相关多肽的生产的手段和方法。在第一方面，本专利技术涉及一种真菌宿主细胞，该真菌宿主细胞在其基因组中包含编码目的多肽的至少一种多核苷酸；和至少一种核酸构建体，该核酸构建体选自由以下组成的组：a)核酸构建体，其包含与编码Ssa2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；b)核酸构建体，其包含与编码Sse2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；c)核酸构建体，其包含与编码Hsc82蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；以及d)(a)、(b)和(c)的任意组合。在第二方面，本专利技术涉及一种核酸构建体，该核酸构建体包含：a)与编码Ssa2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；或b)与编码Sse2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；或c)与编码Hsc82蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子。在第三方面，本专利技术涉及一种用于生产目的多肽的方法，该方法包括：a)提供第一方面的真菌主细胞；b)在有助于目的多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；以及，任选地c)回收该目的多肽。附图说明图1示出了用于米曲霉中ssa2基因过度表达的质粒pAT1917。图2示出了用于米曲霉中ssa2基因和hsc82基因同时过度表达的质粒pAT1818。图3示出了SDS-PAGE，其描绘了在ssa2基因过度表达的米曲霉菌株中LOX的生产。M：分子量；泳道1：菌株DAu614；泳道2：菌株DAu614pAT1818#1；泳道3：菌株DAu614pAT1818#2；泳道4：菌株DAu614pAT1818#4；泳道5：菌株DAu614pAT1818#7；泳道6：菌株DAu614pAT1818#8。图4示出了在过度表达ssa2基因和hsc82基因的米曲霉菌株的培养上清液中脂氧合酶(LOX)的活性。菌株DAu614是生产LOX的参照菌株。菌株DAu614pAT1818是包含实例2中所述载体pAT1818的转化体。图5示出了SDS-PAGE，其描绘了在单独过度表达ssa2基因或过度表达ssa2基因与hsc82基因的组合的米曲霉菌株中卤素过氧化酶的生产。M：分子量；泳道1：菌株BMcA041；泳道2：菌株BMcA041pAT1818#1；泳道3：菌株BMcA041pAT1818#2；泳道4：菌株BMcA041pAT1818#3；泳道5：菌株BMcA041pAT1818#4；泳道6：菌株BMcA041pAT1818#5；泳道7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真菌宿主细胞，该真菌宿主细胞在其基因组中包含编码目的多肽的至少一种多核苷酸；和至少一种核酸构建体，该核酸构建体选自由以下组成的组：/na)核酸构建体，其包含与编码Ssa2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；/nb)核酸构建体，其包含与编码Sse2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；/nc)核酸构建体，其包含与编码Hsc82蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；以及/nd)(a)、(b)和(c)的任意组合。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180326 EP 18163921.21.一种真菌宿主细胞，该真菌宿主细胞在其基因组中包含编码目的多肽的至少一种多核苷酸；和至少一种核酸构建体，该核酸构建体选自由以下组成的组：
a)核酸构建体，其包含与编码Ssa2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；
b)核酸构建体，其包含与编码Sse2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；
c)核酸构建体，其包含与编码Hsc82蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子；以及
d)(a)、(b)和(c)的任意组合。


2.如权利要求1所述的真菌宿主细胞，该真菌宿主细胞包含编码目的多肽的至少一种多核苷酸；以及
i)包含与编码Ssa2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的至少一种核酸构建体，以及包含与编码Sse2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的至少一种核酸构建体；或
ii)包含与编码Ssa2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的至少一种核酸构建体，以及包含与编码Hsc82蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的至少一种核酸构建体；或
iii)包含与编码Sse2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的至少一种核酸构建体，以及包含与编码Hsc82蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的至少一种核酸构建体；或
iv)包含与编码Ssa2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的至少一种核酸构建体，以及包含与编码Sse2蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的至少一种核酸构建体，以及包含与编码Hsc82蛋白的多核苷酸可操作地连接的异源启动子的至少一种核酸构建体。


3.如前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，所述真菌宿主细胞是酵母宿主细胞；优选地，该酵母宿主细胞选自由以下组成的组：假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、和耶氏酵母属细胞；更优选地，该酵母宿主细胞选自由以下组成的组：乳酸克鲁弗酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母和解脂耶氏酵母细胞。


4.如前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，所述真菌宿主细胞是丝状真菌宿主细胞；优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属细胞；更优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、和绿色木霉细胞；甚至更优选地，该丝状真菌宿主细胞选自由以下组成的组：黑曲霉、米曲霉、镶片镰孢和里氏木霉细胞；最优选地，该丝状真菌宿主细胞是米曲霉细胞。


5.如前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该Ssa2蛋白、Sse2蛋白和/或Hsc82蛋白独立地与该真菌宿主细胞同源或异源。


6.如前述权利要求中任一项所述的真菌宿主细胞，其中该Ssa2蛋白与SEQIDNO:2具有至少...

【专利技术属性】
技术研发人员：JM穆伊龙，PH克里斯坦森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK