用于基因疗法的修饰的rAAV衣壳蛋白制造技术

本发明专利技术涉及用于基因疗法的重组的腺相关病毒(rAAV)病毒体，其中所述rAAV病毒体包含新型衣壳蛋白。具体地，本发明专利技术涉及此类病毒体在基因疗法中用于治疗关节炎疾病诸如类风湿性关节炎或其症状的用途，优选地通过关节内施用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因疗法的修饰的rAAV衣壳蛋白
本专利技术涉及基于重组的腺相关病毒(rAAV)的基因疗法的领域，具体地涉及突变衣壳rAAV在治疗或预防关节炎疾病中的用途。
技术介绍
重组的腺相关病毒(rAAV)载体已经展示出在人体内递送基因的优异的安全性和功效特征。因此，rAAV载体广泛用于体内基因疗法并显示对临床前模型以及临床试验安全有效。rAAV载体已在一系列疾病的多种基因疗法临床试验中取得成功，所述疾病包括血友病B、血友病A、囊肿性纤维化、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、脊髓性肌萎缩(SMA)、帕金森病、杜兴氏肌肉营养不良症和莱伯氏先天性黑蒙症(Selot等人,CurrentPharmaceuticalBiotechnology,2013,14,1072-1082)。阿利泼金(Alipogenetiparvovec)(uniQure)作为治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)的基因疗法已在欧洲获得销售许可。随后，对治疗皮肤癌的基于疱疹病毒的Talimogenelaherparepvec(T-Vec，Amgen)和治疗ADA-SCID(GSK)的基于离体干细胞逆转录病毒的基因疗法Strimvelis授予了基因疗法药物许可。基于rAAV载体的基因疗法也应用于类风湿性关节炎(RA)中，这是影响～1％人群的慢性炎性疾病。RA病理遍布滑膜关节。关节的局部性质使得体内基因疗法非常有吸引力。已应用了提供抗炎蛋白的疗法，旨在使RA平衡向抗炎状态偏移。许多工作把重点放在了开发具有期望特性的AAV衣壳蛋白上。此类特性可以包括更高的转导效率、组织/器官趋性、非期望组织/器官的脱靶，或预先存在的中和抗体的避免。然而，在本领域中仍然需要进一步改善rAAV基因疗法载体。具体地，需要改善rAAV基因疗法载体在关节炎疾病中的使用，并且更精确地，需要改善向靶向组织，诸如滑膜关节或滑膜关节内的特定细胞类型，优选地成纤维样滑膜细胞(FLS)递送遗传物质的效率。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术涉及一种用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关的症状的包含修饰的衣壳蛋白的重组的腺相关病毒(rAAV)病毒体，其中修饰的衣壳蛋白在所述蛋白质的C末端部分中包含氨基酸序列Z，所述氨基酸序列Z的残基暴露在衣壳蛋白的表面上。优选地，氨基酸序列Z：包含下式I的氨基酸残基的序列或由其组成：y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A其中x表示单个氨基酸残基或其中y表示0、1或2个氨基酸残基，并且存在于与野生型AAV衣壳蛋白的从C末端起第100–200位，优选地第120–180位，更优选地第130–170位，更优选地第140–160位氨基酸残基相对应的位置处。优选地，式I的氨基酸残基暴露在衣壳蛋白的表面上。在一个优选实施方案中，序列Z在修饰的衣壳蛋白中被包含在由下式II表示的位置处：EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy–Z–(x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG其中Z、x和y如上文所定义；并且其中n为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一个优选实施方案中，本专利技术涉及一种用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关的症状的包含修饰的衣壳蛋白的rAAV病毒体，其中衣壳蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：i)与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:1的第588–602位氨基酸与SEQIDNO:11具有至少80％序列同一性；ii)与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:2的第585–599位氨基酸与SEQIDNO:10具有至少80％序列同一性；iii)与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:3的第587–601位氨基酸与SEQIDNO:9具有至少80％序列同一性；iv)与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:4的第586–600位氨基酸与SEQIDNO:8具有至少80％序列同一性；v)与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:5的第588–602位氨基酸与SEQIDNO:9具有至少80％序列同一性；vi)与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:6的第588–602位氨基酸与SEQIDNO:8具有至少80％序列同一性；以及vii)与具有SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:7的第587–601位氨基酸与SEQIDNO:12具有至少80％序列同一性；其中当在相同条件下测试时，与具有选自由SEQIDNO:13–19组成的组的氨基酸序列的未修饰的衣壳蛋白相比，修饰的衣壳蛋白提供表达的至少两倍增加，其中优选地，未修饰的衣壳蛋白包含具有SEQIDNO:19的氨基酸序列或具有与修饰的衣壳蛋白相同的血清型。在一个优选实施方案中，当在相同条件下测试时，与具有选自由SEQIDNO:13–19组成的组的氨基酸序列的未修饰的衣壳蛋白相比，修饰的衣壳蛋白提供在人FLS细胞中的表达的至少两倍增加，其中优选地，未修饰的衣壳蛋白包含具有SEQIDNO:19的氨基酸序列或具有与修饰的衣壳蛋白相同的血清型。可选地，或与前述实施方案中的任一个相组合，在本专利技术的一个优选实施方案中，衣壳蛋白包含选自由SEQIDNO:1–7组成的组的氨基酸序列，或由其组成。可选地，或与前述实施方案中的任一个相组合，在本专利技术的一个优选实施方案中，rAAV病毒体包含包括至少一个AAV反向末端重复(ITR)序列的核苷酸序列。优选地，病毒体还包含编码目标基因产物的核苷酸序列。甚至更优选地，编码目标基因产物的核苷酸序列位于两个AAVITR序列之间。在一个优选实施方案中，目标基因产物治疗、预防或抑制与关节炎疾病相关的症状，其中优选地，目标基因产物选自由以下组成的组：白介素、免疫调节剂、抗体、shRNA、miRNA、向导RNA、lncRNA、生长因子、蛋白酶、核苷酸酶/核苷酶、肽类、蛋白酶抑制剂、抑制剂、酶以及其组合，并且其中更优选地，目标基因产物为CD39、CD73和IFN-β中的至少一种。可选地，或与前述实施方案中的任一个相组合，在本专利技术的一个优选实施方案中，rAAV病毒体包含以下各项中的至少一个：(i)包含编码至少一个向导RNA的序列的多核苷酸；其中所述或各向导RNA与基因组中的一个或多个靶多核苷酸序列基本上互补；以及(ii)包含编码核酸酶的序列的多核苷酸；其中核酸酶与向导RNA形成核糖核酸酶复合物，并且其中核糖核酸酶复合物在基因组中产生位点特异性双链DNA断裂(DSDB)。在另一方面，本专利技术涉及一种用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关的症状的r本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关的症状的包含修饰的衣壳蛋白的重组的腺相关病毒(rAAV)病毒体，其中所述修饰的衣壳蛋白在所述蛋白质的C末端部分中包含氨基酸序列Z，所述氨基酸序列Z的残基暴露在所述衣壳蛋白的表面上。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180117 EP 18152133.71.一种用于治疗或预防关节炎疾病或用于治疗或预防与关节炎疾病相关的症状的包含修饰的衣壳蛋白的重组的腺相关病毒(rAAV)病毒体，其中所述修饰的衣壳蛋白在所述蛋白质的C末端部分中包含氨基酸序列Z，所述氨基酸序列Z的残基暴露在所述衣壳蛋白的表面上。


2.根据权利要求1所述的rAAV病毒体，其中所述氨基酸序列Z：
a.包含下式I的氨基酸残基的序列或由其组成：
y–G–Q–x–G–(x)3–R–(x)3–y–A–Q–A–A
其中x表示单个氨基酸残基或其中y表示0、1或2个氨基酸残基，并且
b.存在于与野生型AAV衣壳蛋白的从C末端起第100-200位，优选地第120-180位，更优选地第130-170位，更优选地第140-160位氨基酸残基相对应的位置处。


3.根据权利要求1或权利要求2所述所使用的rAAV病毒体，其中所述序列Z包含在所述修饰的衣壳蛋白中通过下式II表示的位置处：
EEEIxxxxPVATExxGxxxxNxQy–Z–(x)nLPGMVWQxRDVYLQGPIWAKIPHTDG
a.其中Z、x和y如权利要求1中所定义，并且
b.其中n为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。


4.根据前述权利要求中任一项所述所使用的rAAV病毒体，其中所述衣壳蛋白包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
i)与具有SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:1的第588-602位氨基酸与SEQIDNO:11具有至少80％序列同一性，
ii)与具有SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:2的第585-599位氨基酸与SEQIDNO:10具有至少80％序列同一性，
iii)与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:3的第587-601位氨基酸与SEQIDNO:9具有至少80％序列同一性，
iv)与具有SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:4的第586-600位氨基酸与SEQIDNO:8具有至少80％序列同一性，
v)与具有SEQIDNO:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:5的第588-602位氨基酸与SEQIDNO:9具有至少80％序列同一性，
vi)与具有SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:6的第588-602位氨基酸与SEQIDNO:8具有至少80％序列同一性，以及
vii)与具有SEQIDNO:7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且其中SEQIDNO:7的第587-601位氨基酸与SEQIDNO:12具有至少80％序列同一性，
其中当在相同条件下测试时，与具有选自由SEQIDNO:13-19组成的组的氨基酸序列的未修饰的衣壳蛋白相比，所述修饰的衣壳蛋白提供表达的至少两倍增加，优选地在人FLS细胞中，其中优选地，所述未修饰的衣壳蛋白具有氨基酸序列SEQIDNO:19或具有与所述修饰的衣壳蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·D·芬，D·格林，K·贝尔纳，S·A·斯内克，N·布雷克斯特拉，S·M·G·范德桑登，
申请(专利权)人：梅里特斯英国第二有限公司，海德堡大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB