一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，该生物标志物包括血液胞外囊泡miRNA生物标志物hsa‑miR‑628‑3p/hsa‑miR‑941和hsa‑miR‑584‑5p/hsa‑mir‑106b‑3p，作为区分肝细胞癌和非肝细胞癌的生物标志物。本发明专利技术首次提出并验证了血液外囊泡miRNA作为生物标志物表达水平区分肝癌患者时具有高敏感性和高阴性预测值，对于肝癌早期诊断具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物及其用途
本专利技术涉及疾病早期检测
，尤其涉及一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂。
技术介绍
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，起源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞，包括肝细胞癌、肝内胆管癌和混合细胞癌，其中75％-85％为肝细胞癌。由于肝细胞癌的侵袭性、生长快、起病隐匿，多数患者确诊时已为晚期，手术的效果大大降低，可供选择的治疗方法也很少。肝细胞癌的预后较差，患者五年生存率小于10％且复发率较高，可手术切除的早期患者五年生存率大幅度提高接近70％。肝细胞癌的主要危险因素包括乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、非酒精性脂肪肝疾病、黄曲霉毒素、饮酒等，在我国关键的决定因素是慢性HBV感染和黄曲霉毒素暴露。同时，80％-90％的肝细胞癌病例是发生在肝硬化背景下。并且对肝细胞癌伴随HBV感染和肝硬化的患者进行筛查和监测可以降低肝细胞癌患者的死亡率。因此，如何准确高效的对早期肝细胞癌患者进行鉴别诊断在临床上具有重要意义。目前，肝细胞癌的诊断方法有胸部影像学、内窥镜超声引导下细针穿刺活检(EUS-FNA)以及甲胎蛋白(AFP)检测等，但这些方法的检测效果在对肝细胞癌诊断时均有一定的局限性。胸部影像学检查方法包括超声造影(CEUS)、CT、核磁共振成像(MRI)和PET-CT等，但影像学检测方法的灵敏度和特异性有限，CT和MRI仅当结节大于1-2cm时诊断价值较高。据报道对于大于2cm的肿瘤MRI的准确率为90％，在小于2cm的肿瘤中准确率降低到33％。而EUS-FNA是一种侵入性检测方法容易引起腹腔内的感染、出血和肿瘤扩散。AFP是基于血液的肿瘤标志物被广泛用于肝细胞癌的早诊和预后，据报道血清中AFP水平大于200ng/mL时对于伴随肝硬化的肝细胞癌患者诊断具有很高的特异性，但只有三分一的肝细胞癌患者血清AFP水平大于100ng/mL，而且AFP诊断的敏感性较低常漏诊早期小肿瘤的患者，无法作为有效的鉴别诊断标志物。因此，急需开发基于微创诊断方法的肿瘤标志物来提高肝细胞癌早期鉴别诊断的效果。胞外囊泡(Extracellularvesicles,EVs)是由多种不同细胞释放到细胞外的囊泡，可分为多种类型。其中，一类小型胞外囊泡，又称外泌体，是一种直径约30-150nm的膜性囊泡。胞外囊泡是由核酸、蛋白质、脂质等组成几乎存在于所有的生物体液中。外周血中游离的胞外囊泡作为一种重要液体活检形式已得到广泛的关注和深入研究，近期，研究显示来源于血液胞外囊泡的miRNA被认为是一种潜在的诊断标志物应用于肝细胞癌的早期诊断。WonSohn等人的研究证实与慢性乙肝和肝硬化组相比肝细胞癌患者血清胞外囊泡miR-18a、miR-221、miR-222、miR-224表达是显著性升高的。而Linhuajun等人的研究表明在与HBV感染和肝硬化组相比肝细胞癌患者血浆胞外囊泡miR-26a、miR-29c、miR-21表达是显著性下调的。然而，这些研究样本量较小、检测胞外囊泡miRNA的数量较少、或缺少独立的验证试验、基于芯片或RT-PCR技术无法发现胞外囊泡中未知的miRNA，导致缺乏来源于血液胞外囊泡的miRNA作为有效的生物标志物对肝细胞癌进行早期鉴别诊断。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提出一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，利用血液外囊泡miRNA作为生物标志物区分非肝细胞癌和肝细胞癌患者时具有高敏感性和高阴性预测值，能够辅助肝癌早期诊断。为实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案包括：一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，所述检测试剂针对性检测的生物标志物包括血液胞外囊泡miRNA生物标志物，所述血液胞外囊泡miRNA生物标志物为hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的组合。进一步地，所述hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的组合生物标志物在肝细胞癌患者的血液胞外囊泡中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。进一步地，所述对照样本为非肝细胞癌患者样本。本专利技术还涉及一种用于肝癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有如上所述的任一种检测试剂。本专利技术还涉及一种基于hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p生物标志物的肝细胞癌和非肝细胞癌分类模型，所述模型包括：其中，Risk-Score为非肝细胞癌和肝细胞癌的风险预测值；x为log2(hsa-miR-628-3p表达量和hsa-miR-941表达量比值)；y为log2(hsa-miR-584-5p表达量和hsa-mir-106b-3p表达量比值)。本专利技术还涉及一种使用如上所述检测试剂在制备通过如下方法进行肝癌早期诊断的试剂盒中的用途，其中所述方法包括以下步骤：S1、采集影像学检测结果疑似为肝细胞癌患者的外周血样本，提取外周血样本中的胞外囊泡并检测外周血胞外囊泡中miRNA的存在；S2、测量所述检测试剂所对应生物标志物的表达值；S3、将获得的表达值带入如上所述的模型中，计算得到疑似患者所患为肝细胞癌或非肝细胞癌的风险预测值。进一步地，所述步骤S2包括使用smallRNA测序获得生物标志物的表达值。本专利技术的有益效果为：采用本专利技术所述用于肝癌早期诊断的生物标志物检测试剂能够从疑似患者外周血中针对性的获取胞外囊泡miRNA生物标志物hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p，能够建立具有高特异性和高敏感性预测的肝细胞癌和非肝细胞癌分类模型，在区分非肝细胞癌和肝细胞癌患者的应用中具有高敏感性和高阴性预测值，特别是可用于结合影像学检测提高肝癌早诊敏感性、降低假阴性。附图说明图1为血液胞外囊泡电镜结果。图2为血液胞外囊泡特征性蛋白表达。具体实施方式为了更清楚的理解本专利技术的内容，将结合附图和实施例详细说明。本专利技术涉及到的所有miRNA都是公开在miRBase数据库中(http://www.mirbase.org/)被注释过的成熟的miRNA。本专利技术的血液胞外囊泡miRNA生物标志物的表达水平建立鉴别模型来协助提高肝癌早期诊断的敏感性和准确性，降低假阴性，减少早期肝癌患者的漏诊，减少患者的额外痛苦、减轻家庭和社会负担。本专利技术所述检测试剂针对性检测的血液胞外囊泡miRNA生物标志物hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的筛选过程包括以下步骤：...

【技术保护点】
1.一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，其特征在于，所述检测试剂针对性检测的生物标志物包括血液胞外囊泡miRNA生物标志物，所述血液胞外囊泡miRNA生物标志物为hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的组合。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于肝癌早期诊断的胞外囊泡microRNA生物标志物检测试剂，其特征在于，所述检测试剂针对性检测的生物标志物包括血液胞外囊泡miRNA生物标志物，所述血液胞外囊泡miRNA生物标志物为hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的组合。


2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/hsa-mir-106b-3p的组合生物标志物在肝细胞癌患者的血液胞外囊泡中的表达值与在对照样本中的表达值相比具有统计学上的显著差异。


3.如权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述对照样本为非肝细胞癌患者样本。


4.一种用于肝癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1至3任一项所述的检测试剂。


5.一种基于hsa-miR-628-3p/hsa-miR-941和hsa-miR-584-5p/h...

【专利技术属性】
技术研发人员：李年丰，李嘉荣，张大东，张继扬，许晓雅，杨旻，黄萌理，张亚楠，陈灏，肖念清，
申请(专利权)人：上海思路迪医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31