SLIT3在制备肺腺癌手术患者预后诊断的试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了SLIT3在制备肺腺癌手术患者预后诊断的试剂盒中的应用。发明专利技术人通过RNA测序(RNA‑seq)鉴别根治手术后13个肺腺癌组织和5个正常肺组织之间的差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，应用基因本体(gene ontology，GO)和KEGG进行分析，通过qRT‑PCR在临床标本、肺腺癌细胞系和正常人支气管上皮细胞系以及来自GEPIA的一个验证队列中确认DEGs的表达，通过生存曲线分析验证，证明SLIT3可作为生物标记物预测肺腺癌手术切除患者的预后情况。

【技术实现步骤摘要】
SLIT3在制备肺腺癌手术患者预后诊断的试剂盒中的应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及SLIT3在制备肺腺癌手术患者预后诊断的试剂盒中的应用。
技术介绍
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。在肺癌的各种病理分型中，肺腺癌(LUAD)约占肺癌的40％，是肺癌最常见的组织病理亚型，其发病率和死亡率均呈上升趋势。绝大多数患者确诊时已是晚期并伴有局部和远处转移性播散，限制了肺腺癌患者的手术选择。然而，早期肺腺癌患者即使行根治性手术切除，预后仍较差。据统计，约50％的患者术后5年内有肿瘤复发或转移，大部分复发或转移发生在手术治疗后1年内。因此，急需有预测性的生物标志物来评估手术切除的肺腺癌患者的早期疗效和预后，这将有助于及时选择辅助治疗，提高患者的预后。近年来的研究中确定了许多基因作为肺癌的预后生物标志物候选基因，包括肺腺癌。比如，通过免疫组织化学染色法和Me4FDGPET发现钠依赖性葡萄糖转运蛋白2(SGLT2)在肺部恶性肿瘤和早期或低级别LUAD中高表达并发挥积极作用，靶向抑制SGLT2在小鼠模型中可显著降低肿瘤生长和延长生存时间，表明SGLT2是早期LUAD潜在的诊断和治疗靶点。基于液滴数字化PCR的DNA甲基化分析发现，高水平HOXA9甲基化单独或合并血管侵犯(BVI)可能导致I期LUAD患者具有较高的侵袭风险或更坏的结局。目前，转录组学分析，如RNA测序(RNA-seq)和微阵列分析等用于发现新的预测性生物标志物，用于肺癌的诊断、预后和疗效评估。RNA-seq是目前转录水平分析基因表达模式的首选方法，其准确性、敏感性和特异性更高，动态范围更广，优于微阵列分析。如基于LUAD患者RNA-seq和10倍scRNA-seq数据的综合分析，发现与肺泡细胞相比，LUAD细胞中有51个基因发生显著改变，其中HMGA1和EMC6的高表达与预后不良相关。然而，目前仍缺乏可靠和可重复的生物标记物预测LUAD切除术后患者的预后与疗效，以指导辅助治疗的选择。SLIT3(Slithomolog3protein)是一种由SLIT3基因编码的分泌蛋白，属于slit家族。在哺乳动物中，Slit家族包括3个成员，分别为SLIT1、SLIT12和SLIT13。SLIT1局限在神经元中，而SLIT2和SLIT3在哺乳动物组织中广泛表达，其失调已在恶性组织中被发现。SLIT2在许多人类癌症中经常被灭活，包括肺癌，SLIT2的肿瘤抑制作用如抑制肿瘤细胞侵袭和迁移、血管生成和生长已得到充分研究。类似的，SLIT3的高甲基化和随后的下调在一些癌症中已经被报道。SLIT3已被证实可通过调控Vimentin、E-cadherin、MMP2和MMP9的表达，抑制癌细胞的生长和侵袭迁移。SLIT3沉默可增强LUAD细胞系A549的侵袭能力。然而，目前仍然缺乏针对SLIT3在癌症中特别是在LUAD中的临床病理和预测意义的综合分析。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供SLIT3在制备肺腺癌手术患者预后诊断的试剂盒中的应用。所述试剂盒为检测SLIT3表达水平的试剂盒。更准确的，所述SLIT3的低表达预示肺腺癌手术患者预后不良。所述试剂盒为实时定量PCR检测试剂盒。更具体的，所述试剂盒包含有检测用引物，其具体序列为：上游引物，5′-TCAATGCCAACAAGATCAACTG-3′；下游引物，5′-CAAATGGGTTTTGGGCTAAGTG-3′。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过RNA测序(RNA-seq)鉴别LUAD根治手术后13个LUAD组织和5个正常肺组织之间的差异表达基因(DEGs)，对鉴别出的差异基因进行GO(GeneOntology)注释以及使用KOBAS软件进行KEGG分析，评估有统计学意义的DEGs，得到SLIT3基因在肺腺癌组织中显著下调，且在log2foldchange和FPKM中均排名前10位，表明SLIT3在正常肺组织和肺腺癌组织中表达存在显著差异。此外，通过GEPIA利用ATCG和GTEx的公开数据、通过qRT-PCR在临床标本和LUAD细胞系的队列中验证DEGs表达谱，与正常肺组织(n＝347)相比，LUAD组织中SLIT3下调(n＝483)，与临床标本的qRT-PCR结果一致，即与非癌组织样本比较，SLIT3在LUAD组织中显著下调(P＜0.01)。免疫组化结果显示SLIT3在3例正常肺组织中有2例呈弱阳性，在6例LUAD组织中呈阴性。FHL1表达能区分肺腺癌患者和非癌患者。最后，通过Kaplan-Meier分析显示SLITS低表达的病人总体生存率较差(P<0.001)，SLIT3可作为预测肺腺癌术后切除患者预后的预后因素，提示SLIT3可作为肺腺癌术后切除患者预后预测的分子标志。本专利技术为肺腺癌术后切除患者的预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和推广性。附图说明图1为DEGs火山图，其中红点代表1873个上调基因，蓝点代表1405个下调基因)。图2为DEGs热图，其中病例组(case)为癌组织，对照组(control)为非肿瘤组织。图3-图8为基因本体论(GO)分析，其中图3-图5分别为上调的DEGs的BP(生物学过程)、MF(分子功能)和CC(细胞成分)，图6-图8分别为下调的DEGs的BP、MF和CC。图9为上调DEGs的KEGG分析。图10为下调DEGs的KEGG分析。图11为FPKM或foldchange(FC)中排名前5％的DEGs构建得到PPI网络。图12为通过MCODE生成的最显著簇。图13为GEPIA的Boxplots显示，在LUAD中，SPP1、IGHG4、IGHG1表达上调，而AGER、SLIT3表达下调(P<0.01)。图14-18为5对配对的LUAD组织标本与正常肺组织中SPP1、IGHG4、IGHG1和AGER、SLIT3的QRT-PCR结果对照比较。图19为LUAD细胞系(A549、H1299、PC9、HCC827)与正常人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)的表达水平比较(P<0.01)。图20为HPA数据库中正常肺组织和肺腺癌组织中SPP1、AGER、SLIT3表达的免疫组化分析。图21为LUAD中SLIT3的总生存图(P<0.05)。具体实施方式一、材料和方法肺腺癌组织和配对的非癌组织(至少距离肿瘤边缘5cm)前瞻性地收集自2018年12月至2019年5月在广西医科大学附属肿瘤医院接受手术切除的肺腺癌患者。选择标准包括：1)病理诊断为LUAD；2)患者在手术前没有接受化疗或放疗；3)患者无其他类型肿瘤史；4)患者有完整的医疗记录。缺乏AJCC分期信息、缺乏组织学信息以及术后30天内死亡或因其他疾病原因死亡的患者被排除，不纳入分析。研究用人体组织经过广西医科大学涉及人体受试者研究的伦理审查委员会审查和批准。二、RNA的提取、定量和鉴定RNA提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SLIT3在制备肺腺癌手术患者预后诊断的试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.SLIT3在制备肺腺癌手术患者预后诊断的试剂盒中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述试剂盒为检测SLIT3表达水平的试剂盒。


3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述SLIT3低表达预示肺腺癌手术患者预后不良。


4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：阳洁，宋锦静，韦彤彤，沈小菊，黎骊，莫小香，莫孝成，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西;45