一种大豆7S抗氧化硒肽的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种大豆7S抗氧化硒肽的制备方法，它包括如下步骤：(1)自大豆盛花期起，进行叶面喷施硒肥，待成熟后收割晒干得到富硒大豆；(2)将富硒大豆粉碎后脱脂，得到脱脂豆粉，从脱脂豆粉中提取7S蛋白；(3)将大豆7S蛋白用水溶解，然后向蛋白溶液中加入蛋白酶进行酶解，灭活后离心取上清液；(4)将上清液用中空纤维超滤膜过滤，滤液冷冻干燥，即得大豆7S抗氧化硒肽。本发明专利技术制备的大豆7S抗氧化硒肽在细胞内和细胞外均具有很好的抗氧化活性，同时还具有水解度和硒含量高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种大豆7S抗氧化硒肽的制备方法
本专利技术涉及一种大豆7S抗氧化硒肽的制备方法。
技术介绍
大豆是人类及畜牧业重要的植物蛋白来源，大豆蛋白主要由2S、7S、11S、15S四种组分组成，其中，7S蛋白约占大豆蛋白的三分之一，它富含对生物体具有重要生理功能的多种成分，但是，目前对大豆11S蛋白的研究较多，而对大豆7S蛋白的研究相对较少。微量元素硒被看作一种重要的食源性抗氧化剂。其清除氧自由基、防止生物膜损伤的功能已得到广泛的认可。在大多数生物体内发挥氧化还原酶的功能，从而保护机体免受氧化损伤。然而，食品中的硒水平相对较低。根据世界卫生组织(WHO)发布的统计数据，全球大约有10亿人存在硒营养不良的问题。研究表明，缺硒会导致如病毒感染、克山病、生殖功能障碍、甲状腺功能紊乱、情绪失调和心血管疾病等一系列疾病的发生。因此，适当的补充硒元素不仅可以维持机体稳态，还能提高抗氧化能力。硒多以SeCys、SeMet的形式存在于多肽链中，硒肽结合了硒与生物活性肽的双重功效。氧化平衡是机体中一种重要的状态。由于机体的内源性反应(如吞噬作用和呼吸作用)和机体暴露于物理和化学物质(如紫外线辐射和空气污染物)，会在机体内产生活性氧。机体内过多的活性氧聚集会造成蛋白质合成受阻、DNA突变、氧化膜磷脂和低密度脂蛋白(LDL)修饰，从而导致细胞稳态的紊乱，甚至严重疾病的发展，如动脉粥样硬化，糖尿病和癌症。近年来，以食物源蛋白质为原料制备的具有抗氧化活性的多肽因其在开发新的天然药物和食品配料方面的潜力，受到广泛的研究关注。与人工合成的食品抗氧化剂(如BHA、BHT等)相比，天然抗氧化肽更加安全可靠，已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大豆7S抗氧化硒肽的制备方法，为了解决现有技术存在的含硒成分少，抗氧化活性缺乏等问题，专利技术所提供的双酶酶解工艺，可提高酶解过程中肽的释放量，并使硒肽的抗氧化活性显著增强。本专利技术的技术解决方案是：一种大豆7S抗氧化硒肽的制备方法，包括如下步骤：(1)自大豆盛花期起，进行叶面喷施硒肥，每隔一天喷施一次，待成熟后收割晒干，即得到富硒大豆；(2)将富硒大豆粉碎后脱脂，得到脱脂豆粉，从脱脂豆粉中提取7S蛋白，冷冻干燥后备用；(3)将大豆7S蛋白用水溶解，然后向蛋白溶液中加入蛋白酶进行酶解，灭活后离心取上清液；(4)将上清液用中空纤维超滤膜过滤，滤液冷冻干燥，即得大豆7S抗氧化硒肽。优选地，所述硒肥中含有0.001-0.1％的亚硒酸钠。优选地，所述7S蛋白的提取方法是：将脱脂豆粉与20-50倍重量的水混合，NaOH溶液调节pH至8-11，搅拌后离心取上清，再用HCl溶液调节上清液pH至6-7，搅拌后离心取上清，最后用HCl溶液调节上清液pH至3-5，搅拌后离心收集沉淀即为7S蛋白。进一步优选地，所述7S蛋白的提取方法是：将脱脂豆粉与30倍重量的水混合，NaOH溶液调节pH至9，搅拌后离心取上清，再用HCl溶液调节上清液pH至6.4，搅拌后离心取上清，最后用HCl溶液调节上清液pH至4.8，搅拌后离心收集沉淀即为7S蛋白。优选地，将7S蛋白用水溶解，配制成3-5％的蛋白溶液，最佳为4％。优选地，所述蛋白酶包括中性蛋白酶和碱性蛋白酶，其添加顺序是先加中性蛋白酶进行酶解，再加碱性蛋白酶进行酶解。进一步优选地，所述中性蛋白酶的添加量为1500-2000U/g7S蛋白，所述碱性蛋白酶的添加量为5500-6500U/g7S蛋白，最佳的，所述中性蛋白酶的添加量为1800U/g7S蛋白，所述碱性蛋白酶的添加量为6000U/g7S蛋白。进一步优选地，所述酶解时间为1-3h，酶解温度为50-60℃。最佳的，所述中性蛋白酶的酶解时间为2h，所述碱性蛋白酶的酶解时间为2h。优选地，所述中空纤维超滤膜的截留分子量为800-1200道尔顿，最佳为1000道尔顿。本专利技术的有益效果是：本专利技术制备的大豆7S抗氧化硒肽在细胞内和细胞外均具有很好的抗氧化活性，同时还具有水解度和硒含量高等优点。硒肽产物中硒含量较大豆粉最高可提高36％，达39.39μg/g，产率最高可达14.5g/100g大豆的高水平。本专利技术制备的硒肽不仅可以作为安全的硒补充剂，解决特殊人群的缺硒问题，还可以作为一种天然抗氧化剂，维持机体氧化平衡，预防氧化相关疾病的发生，同时还为天然大豆的深加工和再利用提供一种新途径。附图说明图1是五种蛋白酶的酶解效果比较。图2是底物浓度对酶解效果的影响。图3是中性蛋白酶添加量对酶解效果的影响。图4是中性蛋白酶酶解时间对酶解效果的影响。图5是碱性蛋白酶添加量对酶解效果的影响。图6是碱性蛋白酶酶解时间对酶解效果的影响。图7是不同级分的大豆7S抗氧化肽的评价。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本专利技术保护范围的限制，任何在本专利技术基础上做出的改变和变化，都在本专利技术的保护范围之内。下面简单介绍硒含量的测定方法，水解度的测定方法，DPPH·自由基清除率的测定方法，以及细胞内抗氧化活性CAAEC50值的测定方法。(1)水解度的测定：采用pH-STAT法对水解度进行测定计算公式：其中：DH：用原料蛋白质中肽键被裂解的百分数表示蛋白质被酶催化水解的程度；B：标准碱液的消耗量(mL)；Nb：标准碱液的摩尔浓度(mol/L)；α：α-氨基酸的离解度，其中pH是反应体系的pH值，pK是反应条件下释放出的α-NH3+的平均解离常数，一般取pK＝7.0，α＝[10(pH-pK)]/[1+10(pH-pK)]；Mp:底物蛋白质的总量(g)；Htot:底物蛋白质中肽键(mmol/g)，对于某一特定的蛋白质而言，Htot是一个常数，如大豆蛋白取7mmol/g。(2)DPPH·自由基清除能力的测定：采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)法测定富硒大豆7S抗氧化肽的抗氧化能力。用无水乙醇溶解9.858mgDPPH，并定容至25mL棕色容量瓶中，配成1mmol/L的DPPH母液，4℃冷藏放置，现配现用。用时取无水乙醇将母液稀释5倍制成0.2mmol/L的溶液。取0.5mL0.2mmol/LDPPH无水乙醇溶液，分别加入0.5mL蒸馏水(A0)和0.5mL样品溶液(A1)，另取0.5mL无水乙醇溶液，加入0.5mL样品(A2)，分别在517nm处测得吸光值A0、A1、A2。按下式计算样品DPPH·自由基的率。DPPH·自由基清除率(％)＝[1－(A1－A2)/A0]×100％(3)细胞内CAAEC50值的测定：将处于对数生长期的HepG-2细胞以6×104/孔的数量接种于含有100μL基础培养基/孔的96孔板中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大豆7S抗氧化硒肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)自大豆盛花期起，进行叶面喷施硒肥，每隔一天喷施一次，待成熟后收割晒干，即得到富硒大豆；/n(2)将富硒大豆粉碎后脱脂，得到脱脂豆粉，从脱脂豆粉中提取7S蛋白，冷冻干燥后备用；/n(3)将大豆7S蛋白用水溶解，然后向蛋白溶液中加入蛋白酶进行酶解，灭活后离心取上清液；/n(4)将上清液用中空纤维超滤膜过滤，滤液冷冻干燥，即得大豆7S抗氧化硒肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种大豆7S抗氧化硒肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)自大豆盛花期起，进行叶面喷施硒肥，每隔一天喷施一次，待成熟后收割晒干，即得到富硒大豆；
(2)将富硒大豆粉碎后脱脂，得到脱脂豆粉，从脱脂豆粉中提取7S蛋白，冷冻干燥后备用；
(3)将大豆7S蛋白用水溶解，然后向蛋白溶液中加入蛋白酶进行酶解，灭活后离心取上清液；
(4)将上清液用中空纤维超滤膜过滤，滤液冷冻干燥，即得大豆7S抗氧化硒肽。


2.如权利要求1所述的大豆7S抗氧化硒肽的制备方法，其特征在于：所述硒肥中含有0.001-0.1％的亚硒酸钠。


3.如权利要求1所述的大豆7S抗氧化硒肽的制备方法，其特征在于：所述7S蛋白的提取方法是，将脱脂豆粉与20-50倍重量的水混合，NaOH溶液调节pH至8-11，搅拌后离心取上清，再用HCl溶液调节上清液pH至6-7，搅拌后离心取上清，最后用HCl溶液调节上清液pH至3-5，搅拌后离心收集沉淀即为7S蛋白。


4.如权利要求3所述的大豆7S抗氧化硒肽的制备方法，其特征在于：所述7S蛋白的提取方法是，...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯焘，张婞，何慧，贾蕾，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42