一种重组A型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种重组A型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术提供了塞内卡病毒重组核酸、包含所述重组核酸的塞内卡重组病毒、包含所述塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株及其制备方法和应用。本发明专利技术对SVV/FJ/001株基因缺失突变改造，在其cDNA中融合进A型FMDV的VP1基因，得到塞内卡重组病毒，该重组病毒能够表达融合进的基因，且表达产物具有良好的反应原性；获得的疫苗株抗原产能高，致病性显著降低甚至对猪无致病性，灭活疫苗免疫动物后不仅能激发SVA的免疫应答，而且能产生针对融合基因的免疫活性，可用于塞内卡病毒及一种或多种非塞内卡病毒的防控。

【技术实现步骤摘要】
一种重组A型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种重组A型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡重组病毒、重组疫苗株及其制备方法和应用。
技术介绍
塞内卡病毒A(SenecavirusA,SVA)，也称塞内卡病毒(Senecavirus)、塞尼卡谷病毒(Senecavalleyvirus,SVV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)，也是该属的唯一成员。该病毒感染猪能够引起猪的原发性水泡病，与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等引起的临床症状难以区分。SVA感染后能引起断奶仔猪、保育、育肥和繁殖的各年龄段的猪发生水泡性病变，同时伴随跛行、发热、厌食、嗜睡等临床症状，新生仔猪除了上述症状外，还可能存在持续的腹泻、脱水等症状，甚至会突然死亡。口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)属于微RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)的单股正链RNA病毒，包括A、O、C、Asial、SAT1、SAT2、SAT3七个血清型，型间无交叉保护。病毒基因组全长约8.5kb，由5’端非编码区、ORF区和3’端非编码区组成。编码区编码一个多聚蛋白，经病毒自身蛋白酶和宿主细胞蛋白酶作用逐级降解，形成多种中间体和成熟的4种结构蛋白(VP4、VP2、VP3、VP1)和8种非结构蛋白(Lpro、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)。其中，VP1作为结构蛋白基因编码所得的最重要的衣壳蛋白，是决定FMDV抗原性、诱导机体产生中和抗体和激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白，且在小RNA病毒科中，VP1被公认为是免疫原性最强的蛋白，因此，作为FMDV的抗原基因，表达VP1蛋白，保持其生物学活性与免疫原性，在FMDV基因工程疫苗的研究方面有重要作用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种重组A型口蹄疫病毒VP1基因的塞内卡病毒重组核酸、包含所述重组核酸的塞内卡重组病毒、由所述重组核酸编码的塞内卡重组病毒、包含所述塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株及其制备方法和应用。本专利技术通过对SVV/FJ/001株进行基因缺失突变改造，同时在SVAcDNA中融合进A型口蹄疫病毒的VP1基因，得到塞内卡重组病毒，该重组病毒能够表达融合进的外源FMDVVP1基因，且表达产物具有良好的反应原性；制备得到的疫苗株抗原产能高、致病性显著降低甚至对猪无致病性；灭活疫苗免疫动物不仅能产生SVA的免疫活性，且能产生针对融合基因的免疫活性。该疫苗株显著提高了生物安全性，可用于塞内卡病毒及一种或多种非塞内卡病毒的防控。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种塞内卡病毒重组核酸，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造，同时在塞内卡病毒cDNA的SphⅠ和NotⅠ酶切位点之间插入A型口蹄疫病毒的VP1基因。优选的，对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造后的5'UTR基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；插入的A型口蹄疫病毒的VP1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，所述塞内卡病毒株包括SVV/FJ/001株。本专利技术还提供了所述重组核酸在制备重组A型FMDVVP1基因的塞内卡病毒重组核酸或塞内卡重组疫苗株中的应用。本专利技术还提供了一种包含所述重组核酸的的重组A型FMDVVP1基因的塞内卡重组病毒。6、一种由权利要求1～3中任一项所述的重组核酸编码的重组A型FMDVVP1基因的塞内卡重组病毒。本专利技术还提供了一种包含所述的塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株。优选的，所述塞内卡重组疫苗株不仅能够激发动物对塞内卡病毒的免疫活性，还能产生针对口蹄疫病毒的免疫活性。本专利技术还提供了所述的塞内卡重组病毒的构建方法，包括如下步骤：(1)以A/GDMM/2013株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增得到A型FMDV的VP1基因；扩增所述VP1基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物AS-R，所述上游引物包括AVP1-F0和AVP1-F，所述上游引物AVP1-F0的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述上游引物AVP1-F的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述下游引物AS-R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；(2)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，利用特异性引物对分别扩增得到SVV/FJ/001株的S1片段和S20片段；扩增所述S1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-1R，所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F；所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；所述下游引物SVA-1R的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；扩增所述S20片段的特异性引物对包括上游引物SVA-2F1和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-2F1的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；(3)将步骤(1)得到的VP1基因片段与所述S20基因片段融合，得S2-AVP1片段；(4)将所述S1片段和S2-AVP1片段分别与pMD20T载体连接，得到亚克隆质粒PMD-S1和PMD-S2-AVP1；(5)以所述亚克隆质粒PMD-S1为模板，用突变引物SVA-m5UTRF和SVA-m5UTRR进行扩增，得到亚克隆质粒PMD-mS1，所述SVA-m5UTRF的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，所述SVA-m5UTRR的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；(6)将质粒PMD-mS1用PacI和SphI双酶切、质粒PMD-S2-AVP1用SphI和NotI双酶切后，回收基因片段，连接替换插入到经PacI和NotI双酶切后的真核转录质粒prO/CHA/99中，得到重组质粒prSVV/FJ-M-AVP1；(7)将得到的所述重组质粒prSVV/FJ-M-AVP1转染塞内卡病毒敏感细胞，获得重组A型FMDVVP1基因的塞内卡重组病毒。优选的，步骤(3)中利用引物AVP1-F和SVA-2R进行融合PCR，使基因片段融合；所述AVP1-F的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述SVA-2R的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。优选的，步骤(5)所述突变后的5'UTR基因片段包括如SEQIDNO.1所示的核酸序列，或包括所述的重组核酸。优选的，步骤(7)所述塞内卡病毒敏感细胞包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。本专利技术还提供了所述重组A型FMDVVP1基因的塞内卡重组病毒或利用所述方法制备得到的塞内卡重组病毒在制备塞内卡重组疫苗中的应用。本专利技术还提供了一种重组A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种塞内卡病毒重组核酸，其特征在于，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造，同时在塞内卡病毒cDNA的SphⅠ和NotⅠ酶切位点之间插入A型口蹄疫病毒的VP1基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种塞内卡病毒重组核酸，其特征在于，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造，同时在塞内卡病毒cDNA的SphⅠ和NotⅠ酶切位点之间插入A型口蹄疫病毒的VP1基因。


2.权利要求1所述重组核酸在制备重组A型FMDVVP1基因的塞内卡病毒重组核酸或塞内卡重组疫苗株中的应用。


3.一种包含权利要求1所述的重组核酸的重组A型FMDVVP1基因的塞内卡重组病毒。


4.一种由权利要求1所述的重组核酸编码的重组A型FMDVVP1基因的塞内卡重组病毒。


5.一种包含权利要求3或4所述的塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株。


6.权利要求3或4所述的塞内卡重组病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以A/GDMM/2013株的cDNA为模板，用特异性引物对扩增得到A型FMDV的VP1基因；扩增所述VP1基因的特异性引物对包括上游引物和下游引物AS-R，所述上游引物包括AVP1-F0和AVP1-F，所述上游引物AVP1-F0的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述上游引物AVP1-F的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述下游引物AS-R的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
(2)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，利用特异性引物对分别扩增得到SVV/FJ/001株的S1片段和S20片段；扩增所述S1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-1R，所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F；所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；所述下游引物SVA-1R的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；
扩增所述S20...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，杨帆，曹伟军，蒋保余，朱紫祥，魏婷，郑敏，田宏，张克山，张伟，刘永杰，党文，马旭升，李丹，茹毅，何继军，郭建宏，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62