一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用，建立方法的步骤如下：(1)制备具有梯度孔径结构的三维间隔织物，三维间隔织物的间隔层的纤维或纱线的排列规律为V字型、X字型或灵活变化型；(2)配制生物活性材料溶液，并将其与三维间隔织物在模具中复合后进行预冷冻和冷冻，制得支架预构体；(3)对支架预构体进行真空干燥，制得复合支架预构体；(4)对复合支架预构体进行交联处理，制得复合多孔支架；(5)将复合多孔支架与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型；应用为：用于药物敏感性检测。本发明专利技术的建立方法简单，能够制备力学稳定且尺寸均一的三维培养模型，以满足体外细胞培养、抗肿瘤药物筛选等的需要。

【技术实现步骤摘要】
一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用
本专利技术属于肿瘤细胞三维培养领域，涉及一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用。
技术介绍
采用传统二维培养模拟生命系统的最主要缺点是细胞只能单层培养，该条件下培养环境中的氧气、营养物质和信号分子的分布与真实生理环境不符合，不能准确反映细胞—细胞外基质、细胞—细胞间的相互作用。在过去的几十年中，随着三维细胞培养技术的出现，在癌症及再生医学领域已经出现大量关于三维细胞培养模型的研究。在研究肿瘤细胞与微环境中细胞外基质及其他细胞间的相互作用时，开发和利用三维培养模型是不可或缺的。现在常用的肿瘤细胞三维培养模型构造方式主要有多细胞肿瘤球体模型(multicellulartumorspheroids，MCTS)及三维支架培养模型。多细胞肿瘤球体模型制作方法多样，通常是利用在低粘附或不粘附表面的条件下培养的细胞悬液，经由聚集和压实作用后制备而成。这种模型目前在商业上已经实现半自动化生产，广泛应用于高通量药物筛选领域，但是该技术制备的多细胞球体尺寸不均一，在一定程度上限制了这种模型的应用。为实现真实的细胞相互作用，亦有研究使用仿生材料和结构，构建类似肿瘤细胞生长微环境的三维支架，利用支架培养细胞形成肿瘤细胞集落。研究人员已经开发了多种支架材料，包括天然生物材料(如纤维素、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、或海藻酸盐)、合成生物材料(如聚己内酯、聚乙烯)和无机材料(如陶瓷、钛)。在应用时，上述材料通常被加工为水凝胶型，或经3D打印及冷冻干燥成单一支架型。如中国专利CN109022342A介绍了一种以手性水凝胶作为贴壁细胞培养的三维培养体系，采用海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖等物质作为促凝剂而建立的贴壁细胞三维培养体系，该三维培养体系拥有良好的生物相容性，能最大程度的模拟体内生物环境，但是由于细胞被固定于手性水凝胶支架中，细胞活性不高，细胞生长量仅提高20～40％。支架也是一种常用的构建肿瘤细胞三维培养模型的方法，如中国专利CN104312975B介绍了一种三维胶原支架，将三维胶原支架置于培养基中浸泡进行预处理，再将成球的胶质瘤干细胞种植于预处理三维胶原支架中，加入内皮培养基共培养若干天后即得到用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，该模型孔径直径为300～500μm，在共培养期间能较好维持细胞的活性，但是由于胶原支架本身力学性能较差且会发生降解，因此不能长时间的维持细胞的高度活性。已有研究者关注到支架的力学性能并介绍了力学性能有所改善的支架，如中国专利CN106676074A公开了一种多孔纤维素支架，该支架刚度为5～100kPa，可诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化并对肿瘤药物有一定的抗敏感性，但是该纤维素支架形状大小并不能保持高度统一，尺寸并不一致，在应用时会出现数据差异。因此，急需开发一种新型的能够有效制备具有力学稳定、尺寸均一性能的三维培养模型的技术，以满足体外细胞培养、抗肿瘤药物筛选及再生医学的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤如下：(1)制备具有梯度孔径结构的三维间隔织物，梯度孔径结构即三维间隔织物的上层与下层的孔径不相同，存在“由大变小”或“由小变大”的变化趋势，上层的平均孔径为2～5mm，下层的平均孔径为1～4mm；孔径过小制备得到的复合支架孔隙率不高，细胞生长效果不理想；孔径过大则会造成支架力学性能不稳定，抗压缩能力变弱；三维间隔织物的间隔层的纤维或纱线的排列规律为V字型、X字型或灵活变化型，“灵活变化型”出自江南大学硕士毕业论文：《经编间隔织物压缩性能研究与表征》；(2)配制生物活性材料溶液，并将其与三维间隔织物在模具中复合后进行预冷冻和冷冻，制得支架预构体；(3)对支架预构体进行真空干燥，制得复合支架预构体；(4)对复合支架预构体进行交联处理，制得复合多孔支架；复合多孔支架具有三维贯通的大量孔洞结构，孔隙率为90％以上，平均孔径为10～50μm(采用多孔测量仪测得)，厚度为3～15mm，长度为5～20mm，宽度为5～20mm；平均孔径过小细胞很难进入支架中生长，有文献报道平均孔径过大也不利于细胞的增殖生长；厚度太小加工难度大，厚度过大细胞很难深入到支架中增殖；长度和宽度可根据不同需要加工成不同大小，可选范围根据需要的尺寸可进行变动；复合多孔支架的力学性能稳定，形变为自身厚度50％时最大压缩强力为200～1300cN，在应用时能保持形状不变，复合多孔支架适于肿瘤细胞生长增殖，且给细胞提供了三维生长的空间，传质性能优异；三维间隔织物的“上层的平均孔径为2～5mm，下层的平均孔径为1～4mm”使其能够负载生物活性材料，经过预冷冻、冷冻、真空干燥、铰链处理之后就得到了具有三维贯通的大量孔洞结构、孔隙率为90％以上、平均孔径为10～50μm的复合多孔支架，间隔层纱线的排列和纱线本身具有的刚度使复合多孔支架的力学性能优异；(5)将复合多孔支架与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型。本专利技术选用具有梯度孔径结构的三维间隔织物与生物活性材料复合制备复合多孔支架，再将其与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型，所有的三维间隔织物都具有三明治型结构，三明治型结构具体为上层-间隔层-下层，间隔层连接了上层和下层，这种连接使三维间隔织物具有三层结构且不易松散，从而使得三维间隔织物具有良好的力学稳定性；此外，间隔层的纤维或纱线的排列规律为V字型、X字型或灵活变化型，这种排列方式使得三维间隔织物具有良好的力学性能，具体表现在施加外力导致间隔织物变形后，能快速恢复到变形之前的形状及状态，进一步提升了三维间隔织物的力学稳定性；此外，三明治型结构中上层和下层分布有大量孔洞，纤维与纤维之间也存在一定间隙，三明治型结构导致三维间隔织物具有极高的孔隙率，本专利技术同时控制了三维间隔织物具有梯度孔径结构，梯度孔径结构能模拟体内肿瘤微环境的物质梯度分布，极高的孔隙率和梯度孔径结构为细胞的三维生长提供了介质(营养物质和代谢废物)流通的环境；此外，三维间隔织物自身具有尺寸均一的特点，由于其原料为纤维或纱线，使用剪刀等工具易于剪裁成多种形状及尺寸，具体表现在细胞培养时需要用到不同形状及大小的培养板。作为优选的技术方案：如上所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤(1)中，三维间隔织物中，上层和下层的纤维或纱线的种类相同或不同，选自于丙纶和涤纶，粗细相同或不同；丙纶和涤纶是两种能用于生物医用材料的高分子聚合物，限制于机器的加工要求，能用于被加工成间隔织物的纱线种类最好是这两种。间隔层的纤维或纱线的种类为锦纶或涤纶，间隔层的纤维或纱线要求具有一定的强度，以支撑织物的两个表面及外界的压力，使支架具有一定的厚度和弹性；三维间隔织物采用双针床拉舍尔经编机一体化加工而成，尺寸均一可控；三维间隔织物织造过程本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征是，步骤如下：/n(1)制备具有梯度孔径结构的三维间隔织物，梯度孔径结构即三维间隔织物的上层与下层的孔径不相同，上层的平均孔径为2～5mm，下层的平均孔径为1～4mm，三维间隔织物的间隔层的纤维或纱线的排列规律为V字型、X字型或灵活变化型；/n(2)配制生物活性材料溶液，并将其与三维间隔织物在模具中复合后进行预冷冻和冷冻，制得支架预构体；/n(3)对支架预构体进行真空干燥，制得复合支架预构体；/n(4)对复合支架预构体进行交联处理，制得复合多孔支架；复合多孔支架具有三维贯通的大量孔洞结构，孔隙率为90％以上，平均孔径为10～50μm，厚度为3～15mm，形变为自身厚度50％时最大压缩强力为200～1300cN；/n(5)将复合多孔支架与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征是，步骤如下：
(1)制备具有梯度孔径结构的三维间隔织物，梯度孔径结构即三维间隔织物的上层与下层的孔径不相同，上层的平均孔径为2～5mm，下层的平均孔径为1～4mm，三维间隔织物的间隔层的纤维或纱线的排列规律为V字型、X字型或灵活变化型；
(2)配制生物活性材料溶液，并将其与三维间隔织物在模具中复合后进行预冷冻和冷冻，制得支架预构体；
(3)对支架预构体进行真空干燥，制得复合支架预构体；
(4)对复合支架预构体进行交联处理，制得复合多孔支架；复合多孔支架具有三维贯通的大量孔洞结构，孔隙率为90％以上，平均孔径为10～50μm，厚度为3～15mm，形变为自身厚度50％时最大压缩强力为200～1300cN；
(5)将复合多孔支架与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型。


2.根据权利要求1所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，三维间隔织物中，上层和下层的纤维或纱线的种类相同或不同，选自于丙纶和涤纶，粗细相同或不同；
间隔层的纤维或纱线的种类为锦纶或涤纶；
三维间隔织物采用双针床拉舍尔经编机一体化加工而成；
三维间隔织物织造过程中采用空穿梳栉工艺。


3.根据权利要求1所述的一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，生物活性材料溶液的配制过程如下：
(2.1)按照1:99～399的质量比将生物活性材料混合于玻璃瓶内的乙酸溶液中，在常温下，使用磁力搅拌器以400～800r/min的转速搅拌进行溶解；
(2.2)将玻璃瓶倒置后搅拌4～48h；
(2.3)将玻璃瓶中混合物经离心后取上清液，制备得到生物活性材料溶液；

【专利技术属性】
技术研发人员：李超婧，刘星星，胡梦博，徐晨阳，姜昊文，王富军，王璐，
申请(专利权)人：东华大学，复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31