一种人重组乙型干扰素的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种人重组乙型干扰素的高效制备方法，所述方法包括：通过将亮氨酸拉链1、类泛素修饰分子羧基端与乙型干扰素融合，并在酵母系统高效表达，获得亮氨酸拉链1‑类泛素修饰分子羧基端‑乙型干扰素融合蛋白；将所述的融合蛋白，与类泛素修饰分子氨基端‑亮氨酸拉链2蛋白分子混合，亮氨酸拉链1与亮氨酸拉链2可相互作用形成亮氨酸拉链二聚体，从而使得类泛素修饰分子羧基端与类泛素修饰分子氨基端重组成为完整的类泛素分子重建物，用类泛素修饰分子特异性蛋白酶处理该重建物，从而获得与自然人乙型干扰素结构和功能相似的重组人乙型干扰素。本发明专利技术具有表达水平高、工艺简单、保持蛋白结构和活性等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种人重组乙型干扰素的制备方法本申请是申请日为2014年4月9日、中国申请号为2014101411186、专利技术名称为“一种人重组乙型干扰素的制备方法”的专利技术申请的分案申请。
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种人重组乙型干扰素的制备方法。
技术介绍
乙型干扰素(又称为β干扰素，Interferon-β，IFN-β)是由体内纤维细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子，是一种糖蛋白，含166个氨基酸，分子量约为20，500道尔顿，具有抗炎症功能，抗病毒、抗增殖以及免疫调节活性，其作为药物可广泛用于抗感染、抗肿瘤和拮抗自身免疫性疾病。尽管乙型干扰素已经在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和中国仓鼠卵巢癌细胞中进行表达，然而，由这些系统所表达和生产的蛋白量相对较少。小分子类泛素修饰蛋白(smallubiquitin-likemodifier，SUMO)具有高度类似泛素的桶状蛋白结构，具有相当的保守性，能够提供蛋白正确折叠的核心，极大提高了目的蛋白的溶解性，已经证明是最好的提高可溶蛋白表达量的标签之一。并且，SUMO这个融合的蛋白标签可以在体外用源于酵母的SUMO特异的蛋白水解酶Ulp1极为高效的切割掉，从而获得与目的蛋白完全相同的重组蛋白质。然而，在真核表达系统中，由于存在大量的内源的SUMO特异性的蛋白水解酶(如酿酒酵母中的Ulp1和哺乳动物细胞中的SENPn系列蛋白质)，SUMO蛋白标签会被迅速的切割掉，从而失去了作为蛋白标签所起的促溶和增进表达量作用，因而在真核系统中作用不显著。
技术实现思路
r>本专利技术的目的是提供一种人重组乙型干扰素的制备方法，该方法能够在酵母细胞系统中获得高产量的与自然人乙型干扰素结构和功能相似的重组人乙型干扰素。本专利技术所述的一种人重组乙型干扰素的制备方法，包括以下步骤：(a)通过将亮氨酸拉链1、类泛素修饰分子羧基端与乙型干扰素融合，并在酵母系统高效表达，获得亮氨酸拉链1-类泛素修饰分子羧基端-乙型干扰素融合蛋白，分离所述融合蛋白，其序列如SEQIDNO.1所示；(b)将所述的融合蛋白，与类泛素的修饰分子氨基端-亮氨酸拉链2蛋白分子混合，所述类泛素的修饰分子氨基端-亮氨酸拉链2蛋白分子的序列如SEQIDNO.2所示；所述亮氨酸拉链2与亮氨酸拉链1可相互作用形成亮氨酸拉链二聚体，从而生成类泛素分子重建物；所述类泛素分子重建物包含：由亮氨酸拉链1和亮氨酸拉链2相互作用形成的亮氨酸拉链二聚体、重建的类泛素分子以及乙型干扰素蛋白；(c)用类泛素分子的特异性蛋白酶处理步骤b的重建物，从而将亮氨酸拉链二聚体和重建的类泛素分子切割下来，分离获得与自然人乙型干扰素结构和功能相似的重组人乙型干扰素。根据本专利技术所述的制备方法的进一步特征，所述的类泛素修饰分子选自：SUMO、泛素(ubiqutin)，NEDD8(neuralprecursorcellexpresseddevelopmentallydown-regulated8)，干扰素刺激蛋白15(ISG15Interferon-stimulatedprotein15)，延伸素B(ElonginB)，泛素类似物l(RublRELATEDTOUBIQUITINI)。优选地，所述的类泛素修饰分子是SUMO。根据本专利技术所述的制备方法的进一步特征，所述SUMO的羧基端区域具有SEQIDNO.1中第52-96位的氨基酸序列；或者所述SUMO的氨基端区域具有SEQIDNO.2中第9-62位的氨基酸序列。根据本专利技术所述的制备方法的进一步特征，所述的亮氨酸拉链1具有SEQIDNO.1中第14-43位的氨基酸序列；或者所述的亮氨酸拉链2具有SEQIDNO.2中第69-97位的氨基酸序列。根据本专利技术所述的制备方法的进一步特征，所述步骤(a)中，在所述的亮氨酸拉链1的编码基因和类泛素分子羧基端区域的编码基因之间还包括一连接序列。根据本专利技术所述的制备方法的进一步特征，所述的连接序列编码SEQIDNO.1中第44-51位的氨基酸序列。根据本专利技术所述的制备方法的进一步特征，所述步骤(b)中，在所述的类泛素分子氨基端区域和亮氨酸拉链2之间还包括一连接序列。根据本专利技术所述的制备方法的进一步特征，所述的连接序列如SEQIDNO.2中第63-68位所示。根据本专利技术所述的制备方法的进一步特征，所述步骤(a)中，所述的融合蛋白还含有至少一个纯化用标签的编码基因；或者所述步骤(b)中，所述的类泛素分子重建物还包含至少一个纯化用标签。为了能够在酵母表达系统中使用SUMO标签提高乙型干扰素表达水平，本专利技术采用了一种HalfSUMO互补表达系统。将SUMO分为氨基端和羧基端结构域(NTHS和CTHS)两部分，将羧基端与乙型干扰素融合，由于羧基端继承了SUMO的大部分保守蛋白结构域，具有甚至优于SUMO的促溶效果，并且无法被内源性的蛋白水解酶识别和切割，从而可以在酵母系统中使用。在纯化好的SUMO羧基端-乙型干扰素融合的目的蛋白中，加入SUMO的氨基端蛋白分子，重组成为完整的SUMO分子，被外加的类泛素修饰分子特异性蛋白酶(Ulp1)所识别，以将融合的SUMO羧基端标签移除得到与自然人乙型干扰素结构和功能相似的重组人乙型干扰素。附图说明图1为酵母中His-Zipperl-CTHS-IFN诱导表达结果。图2为His-Zipper1-CTHS-IFN与His-NTHS-Zipper2重建SUMO蛋白分子后经SUMO蛋白酶切后，利用Ni-NTA亲和层析，纯化获得乙型干扰素蛋白。图3为乙型干扰素细胞病变抑制结果。具体实施方式本文中，所述的“亮氨酸拉链(leucinezipper)二聚体”是指来自不同多肽链的两个两用性的α-螺旋的疏水面(常常含有亮氨酸残基)相互作用形成一种圈对圈的二聚体结构。通常，亮氨酸拉链是由伸展的氨基酸组成，每7个氨基酸中的第7个氨基酸是亮氨酸，亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在伐，螺旋的一侧，所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧。当两条多肽相互接近时，亮氨酸之间相互作用形成二聚体，从而形成“拉链”。本文中，所述的“亮氨酸拉链1”或“亮氨酸拉链2”是指当它们分别位于两条多肽链上时，并且两条多肽链相互接近时，可以发生相互作用并形成亮氨酸拉链二聚体的分子。以下结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，目的在于解释本专利技术的内容而非限制专利技术的保护范围。下面实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等人著，分子克隆：试验指南(NewYork，ColdSpringHabourLaboratoryPress)中所述条件，或按照制造厂商建议条件进行。I.材料和方法质粒和菌株大肠杆菌DH5、BL21和用于酵母表达的毕赤酵母菌株X33(购自Invitrogen)。用于酵母表达的pPICZαA购自Invitrogen公司。培养基或缓冲液的配方：(1)LuriaBertani(LB)培养基Bacto-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人重组乙型干扰素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(a)通过将亮氨酸拉链1、类泛素修饰分子羧基端与乙型干扰素融合，并在酵母系统高效表达，获得亮氨酸拉链1-类泛素修饰分子羧基端-乙型干扰素融合蛋白，分离所述融合蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示；/n(b)将所述的融合蛋白，与类泛素的修饰分子氨基端-亮氨酸拉链2蛋白分子混合，所述类泛素的修饰分子氨基端-亮氨酸拉链2蛋白分子的序列如SEQ ID NO.2所示；所述亮氨酸拉链2与亮氨酸拉链1可相互作用形成亮氨酸拉链二聚体，从而生成类泛素分子重建物；所述类泛素分子重建物包含：由亮氨酸拉链1和亮氨酸拉链2相互作用形成的亮氨酸拉链二聚体、重建的类泛素分子以及乙型干扰素蛋白；/n(c)用类泛素分子的特异性蛋白酶处理步骤b的重建物，从而将亮氨酸拉链二聚体和重建的类泛素分子切割下来，分离获得与自然人乙型干扰素结构和功能相似的重组人乙型干扰素。/n

【技术特征摘要】
1.一种人重组乙型干扰素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)通过将亮氨酸拉链1、类泛素修饰分子羧基端与乙型干扰素融合，并在酵母系统高效表达，获得亮氨酸拉链1-类泛素修饰分子羧基端-乙型干扰素融合蛋白，分离所述融合蛋白，其序列如SEQIDNO.1所示；
(b)将所述的融合蛋白，与类泛素的修饰分子氨基端-亮氨酸拉链2蛋白分子混合，所述类泛素的修饰分子氨基端-亮氨酸拉链2蛋白分子的序列如SEQIDNO.2所示；所述亮氨酸拉链2与亮氨酸拉链1可相互作用形成亮氨酸拉链二聚体，从而生成类泛素分子重建物；所述类泛素分子重建物包含：由亮氨酸拉链1和亮氨酸拉链2相互作用形成的亮氨酸拉链二聚体、重建的类泛素分子以及乙型干扰素蛋白；
(c)用类泛素分子的特异性蛋白酶处理步骤b的重建物，从而将亮氨酸拉链二聚体和重建的类泛素分子切割下来，分离获得与自然人乙型干扰素结构和功能相似的重组人乙型干扰素。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的类泛素修饰分子是SUMO。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述SUMO的羧基端区域具有SEQIDNO.1中第52-96位的氨基酸序列；或者所述SU...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华平，张金阔，钱柳青，范名俊，朱苗苗，
申请(专利权)人：广州复能基因有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44