一种结合于NK92细胞的靶向纳米探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种结合于NK92细胞的靶向纳米探针及其制备方法和应用。本发明专利技术合成了靶向于NK92细胞的Fe

【技术实现步骤摘要】
一种结合于NK92细胞的靶向纳米探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及医学影像学和纳米医学领域，具体地说，涉及一种结合于NK92细胞的靶向纳米探针及其制备方法和应用。
技术介绍
自然杀伤(naturalkill，NK)细胞作为肿瘤免疫治疗的一种治疗模式越来越受到重视。通常评价免疫治疗效果是通过肿瘤标记物的减少、肿瘤体积的减少及生存率的改善等指标，这往往需要有创活检病理且耗时。分子影像探针能够在分子水平对肿瘤的发生、发展进行实时无创成像，同时也可以指导和监控靶向治疗，从而实现肿瘤的诊疗一体化。因而应用分子影像学技术标记免疫细胞的纳米技术，带动了许多免疫细胞特异靶向及无创示踪评估纳米技术的发展，增加了对免疫细胞参与癌症发展及转移机制的理解。文献(崔凤,徐玉清,于常华,等.小鼠DC、NK细胞体外诱导、增殖及示踪方法[J].哈尔滨医科大学学报,2006,40(001):42-44.)公开了建立C57BL/6小鼠皮下黑素瘤模型，体外诱导增殖小鼠脾源性NK细胞及骨髓源性DC，进行电镜观察，并在体外以Brdu，DAPI标记，混合两种细胞回输荷瘤小鼠体内，观察肿瘤组织中两种细胞的示踪情况。结果Brdu对细胞的标记率约65％，DAPI对细胞的标记率可达100％；在荧光显微镜下可见肿瘤组织切片中外源性DC，NK细胞的分布。进一步得出结论：Brdu，DAPI均可作为外源性细胞体内示踪的标记方法。文献(SheuAY,ZhangZ,OmaryRA,etal.MRI-monitoredtranscatheterintra-arterialdeliveryofSPIO-labelednaturalkillercellstohepatocellularcarcinoma:preclinicalstudiesinarodentmodel.[J].InvestigativeRadiology,2013,48(6):492-499.)公开了经动脉导管灌注超顺磁性氧化铁(SPIO)标记的NK细胞到大鼠模型肝细胞癌病灶区，能够通过MRI检查定量评估肝细胞癌病灶内NK细胞数量和判断疗效。文献(安洁.分子影像技术监测NK细胞过继免疫治疗肝癌的作用效果及其机制研究[D].)公开了应用组成性表达萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase，Fluc)的C57BL/6J转基因小鼠为供者NK细胞来源，分离出带有Fluc标记的供者NK细胞，再过继输注到受者小鼠体内，通过活体生物发光成像(Bioluminescenceimaging，BLI)建立NK细胞的体内分子影像监测技术平台，结果显示Fluc+NK细胞过继输注后其荧光信号可在受者小鼠体内持续16d，整体呈现逐渐增强，至8d全身分布最广、信号最强，后又逐渐下降的抛物线趋势。然而，目前未见如本申请的结合于NK92细胞的Fe3O4-PEG-CD56/Avastin@Ce6纳米探针。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种结合于NK92细胞的靶向纳米探针及其制备方法和应用。第一方面，本专利技术提供一种结合于NK92细胞的靶向纳米探针，所述靶向纳米探针是在超顺磁性Fe3O4纳米粒子表面共价连接靶向NK细胞的抗CD56抗体以及抗肿瘤药物贝伐珠单抗，再于表面物理吸附光敏剂Ce6。作为本专利技术的一种优选实施方案，所述超顺磁性Fe3O4纳米粒子用mPEG-COOH修饰，再连接所述抗CD56抗体和所述贝伐珠单抗。作为本专利技术的另一优选实施方案，所述靶向纳米探针制备方法为：(1)制备Fe3O4-PEG-COOH；(2)制备Fe3O4-PEG-CD56/Avastin；(3)制备Fe3O4-PEG-CD56/Avastin@Ce6。更优选地，所述步骤(1)，其具体方法为：用SBB9缓冲液配制EDC和NHS的混合溶液，加入Fe3O4纳米粒子，再加入mPEG-COOH反应，离心，收集得到Fe3O4-PEG-COOH溶液。更优选地，所述步骤(2)，其具体方法为：用SBB9缓冲液配制EDC和NHS的混合溶液，将所述EDC和NHS的混合溶液、SBB9缓冲液先后加入步骤(1)的Fe3O4-PEG-COOH溶液，再加入抗CD56抗体和贝伐珠单抗，室温反应，离心，收集得到Fe3O4-PEG-CD56/Avastin溶液。更优选地，所述步骤(3)，其具体方法为：将Ce6溶液及超纯水先后加入所述Fe3O4-PEG-CD56/Avastin溶液中，混合均匀，震荡反应，然后使用透析袋透析，得到所述Fe3O4-PEG-CD56/Avastin@Ce6。作为本专利技术的另一优选实施方案，制备过程中，所述CD56和Avastin的加入量的质量比为0.0078125:(3.9～42.9)。第二方面，本专利技术提供如上任一所述的靶向纳米探针的制备方法。第三方面，本专利技术提供如上任一所述的靶向纳米探针在制备NK细胞影像探针中的应用。第四方面，本专利技术提供如上任一所述的靶向纳米探针在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术优点在于：1、本专利技术提供了一种新型的NK细胞的靶向纳米探针，具体选用Fe3O4作为MRI对比剂，通过mPEG-COOH修饰共价连接靶向NK细胞的抗CD56抗体以及抗肿瘤药物Avastin，再物理吸附光敏剂Ce6，制备得到所述探针。该探针可以在MRI及荧光下双模态成像。2、理想的分子影像探针是分子影像学发挥优势的先决条件。探针通常由可用于示踪的信号组分及靶向组分构成。如何提高分子影像探针的生物相容性、悬浮分散稳定性、主动靶向性等特性，是决定探针能否顺利对特定细胞标记和长期监测的关键。本申请所选择的对比剂、抗体、药物和光敏剂种类和修饰方式提高了探针对NK细胞靶向性，使探针能被NK细胞大量摄取，且探针体内稳定性好，因此有利于NK细胞的长期监测和机制研究。3、本专利技术的探针标记的NK细胞输注动物体内后能有效地聚集于肿瘤组织，对肿瘤细胞的杀伤力增强。4、体外实验表明本专利技术的探针在不同浓度下对NK细胞均无毒性。我们还对结合纳米探针的NK-92细胞的体内毒性进行了探讨，通过取出治疗15天后的小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾组织，对这些主要器官进行HE染色，结果发现各组间主要组织器官之间没有明显差异，各组间细胞排列整齐，无明显的细胞凋亡及坏死，证明了探针标记的NK细胞对小鼠安全无害。同时在治疗期间小鼠的体重也没有发生明显的改变，也同样证明了结合探针的NK-92细胞对小鼠是安全无害的。附图说明图1：紫外吸收光谱图。图2：A，TEM图；B，粒径分布图。图3：流式定量显示细胞摄取材料图。图4：Fe3O4-PEG-CD56/Avastin@Ce6对NK92细胞凋亡比例的影响。图5：MRI成像。A：Fe3O4-PEG-CD56/Avastin@Ce6标记的NK细胞，1、2、3分别对应0、10、20μg/mL；B：1、对照组：未结合材料的NK细胞；2、10μg/mL的Fe3O4-PE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合于NK92细胞的靶向纳米探针，其特征在于，所述靶向纳米探针是在超顺磁性Fe

【技术特征摘要】
1.一种结合于NK92细胞的靶向纳米探针，其特征在于，所述靶向纳米探针是在超顺磁性Fe3O4纳米粒子表面共价连接靶向NK细胞的抗CD56抗体以及抗肿瘤药物贝伐珠单抗，再于表面物理吸附光敏剂Ce6。


2.根据权利要求1所述的靶向纳米探针，其特征在于，所述超顺磁性Fe3O4纳米粒子用mPEG-COOH修饰，再连接所述抗CD56抗体和所述贝伐珠单抗。


3.根据权利要求1所述的靶向纳米探针，其特征在于，所述靶向纳米探针制备方法为：
(1)制备Fe3O4-PEG-COOH；
(2)制备Fe3O4-PEG-CD56/Avastin；
(3)制备Fe3O4-PEG-CD56/Avastin@Ce6。


4.根据权利要求3所述的靶向纳米探针，其特征在于，所述步骤(1)，其具体方法为：用SBB9缓冲液配制EDC和NHS的混合溶液，加入Fe3O4纳米粒子，再加入mPEG-COOH反应，离心，收集得到Fe3O4-PEG-COOH溶液。


5.根据权利要求3所述的靶向纳米探针，其特征在于，所述步骤(2)，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李康安，连婧阁，高国，段猛，
申请(专利权)人：上海市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31