激活WNT信号传导的多价结合分子及其用途制造技术

本文描述影响多价结合分子与细胞上的FZD受体和Wnt共受体结合的方法，其中所述多价结合分子与细胞上的FZD受体和共受体两者的结合激活Wnt信号通路。本文还描述激活Wnt信号通路的多价结合分子及其使用方法，所述多价结合分子包含在Fc结构域的任一端上的FZD受体结合结构域和Wnt共受体结合结构域。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】激活WNT信号传导的多价结合分子及其用途本申请要求2018年2月14日提交的美国临时申请号62/630,772的基于35U.S.C.119(e)的权益，其全部内容通过引用并入本文。本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式进行电子提交，并且通过引用其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2019年2月12日，命名为115773_PA895WO_SL.txt，大小为220,360字节。
技术介绍
Wnt信号通路对于成人的胚胎发育和组织内稳态是至关重要的。Wnt配体是分泌的生长因子，其调节各种细胞进程，例如增殖、分化、存活和迁移。Wnt配体对于控制组织干细胞自我更新和调节许多祖细胞群是普遍重要的。Wnt蛋白的疏水性和敏感的三级结构使其生化纯化具有挑战性，并且无法在体内和体外使用。在人类中存在19种Wnt配体，它们与10个卷曲蛋白细胞表面受体(FZD)和几种指导不同细胞内信号传导分支的选择性参与的共受体之一的网络相互作用(Wodarz,A.和Nusse,R.Annu.Rev.CellDev.Biol.14,59–88(1998)；Angers,S和Moon,R.T.,transduction.Nat.Rev.Mol.CellBiol.10,468–477(2009))。FZD具有保守的结构特征，包括七个疏水跨膜结构域和富含半胱氨酸的配体结合结构域。已知FZD在三种不同的信号通路中起作用，称为Wnt平面细胞极性(PCP)通路、典型Wnt/β-连环蛋白通路、和Wnt/钙通路。Wnt信号通路的激活还需要Wnt共受体的存在，以指示细胞内信号传导级联的差异性参与，调节影响作为上述列举的细胞进程的基础的细胞机制的基因的表达。例如，Wnt配体与卷曲蛋白受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(LRP5/6)共受体家族的成员结合，以激活Wnt/β-连环蛋白通路，或与涉及受体酪氨酸激酶(RYK)或蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)共受体的受体酪氨酸激酶样孤儿受体1和2(ROR1/2)一起，以启动Wnt/PCP通路或可替换的不依赖β连环蛋白的信号通路。Wnt/β-连环蛋白通路，有时也称为典型通路，在转录效应子β-连环蛋白的翻译后积累中达到顶峰，β-连环蛋白与转录因子T细胞因子/淋巴增强因子(LEF/TCF)家族相互作用，以调节特定背景基因的表达。
技术实现思路
Wnt需要脂化来发挥功能(Janda等人,Science.337,59–64(2012)；Kadowaki等人,GenesDev.10,3116–3128(1996))，其疏水性使生化操作复杂化；因此，仅少数Wnt被纯化(Willert等人,Nature423,448–452(2003)。此外，Wnt对多种受体具有固有的交叉反应性，特别是当过表达或以高剂量应用时(He等人Science.275,1652–1654(1997)；Andres等人SystematicmappingofWnt-FrizzledinteractionsrevealsfunctionalselectivitybydistinctWnt-Frizzledpairs.JournalofBiological(2015)(获得自http://www.jbc.org/content/early/2015/01/20/jbc.M114.12648.short)；Holmen等人,J.Biol.Chem.277,34727–34735(2002))。因此，不可能选择性地激活卷曲蛋白受体复合物以确定在不同情况下各自的特定功能或评估其对退行性病况的治疗潜力。如本文所述的多价结合分子和方法选择性地激活预选的卷曲蛋白受体-共受体复合物。预期如本文所述的多价结合分子的施用通过激活合适的卷曲蛋白共受体复合物来治疗退行性病况。本文描述影响肽与细胞上的FZD受体和Wnt共受体结合的方法，其中肽与FZD受体和共受体两者的结合激活Wnt信号通路。本文还描述激活Wnt信号通路的多价结合分子及其使用方法。多价结合分子与FZD受体和Wnt共受体两者结合，从而激活Wnt信号通路。本专利技术的多价结合分子在本文中也称为“FZD激动剂”或“FZDag”。在其中本专利技术的分子结合FZD和LRP5/6的特定实施方案中，该分子可以被称为“卷曲蛋白和LRP5/6激动剂”或“FLAg”。多价结合分子包含Fc结构域或其包含CH3结构域的片段、以及结合FZD受体的第一结合结构域和结合Wnt共受体的第二结合结构域，其中FZD结合结构域与Fc结构域的一末端连接，并且共受体结合结构域与Fc结构域的另一末端连接。因此，用于FZD受体的结合结构域和用于共受体的结合结构域不直接连接，而是由Fc结构域、或其包含CH3结构域的片段分开。结合结构域的这种构象产生出乎意料的高水平的Wnt信号通路激活。FZD结合结构域可以是具有FZD受体的单个结合位点(互补位)的一价的、或者可以是具有FZD受体的超过一个结合位点的多价的，例如，结合结构域可以是二价、三价或四价。Wnt共受体结合结构域可以是具有Wnt共受体的单个结合位点(互补位)的一价的、或者可以是具有Wnt共受体的超过一个结合位点的多价的，例如，结合结构域可以是二价、三价或四价。如本文所述的用于产生多价结合分子的方法使得能够在体外和体内选择性地且强力地激活任何FZD受体复合物。利用靶向FZD及其共受体的数百种合成抗体的组，我们产生用于选择性地且合理地激活一个、两个或多个FZD受体的多价结合分子。本专利技术的多价结合分子是高度稳定的，适于大规模生产和容易纯化，具有可预测的药代动力学，并预期表现出低免疫原性。在本专利技术的一个实施方案中，如本文所述的多价结合分子的结合结构域与一个以上的FZD受体和LRP例如LRP5和/或LRP6结合，并且在本文中可替代地称为FLAg。靶向特定FZD及其LRP共受体的FLAg将改善定向分化和细胞疗法，维持组织类器官的生长，并在体内动员内源性干细胞，促进损伤后的组织修复，并在组织变性后恢复功能。FZD激动剂的Fc结构域可以是免疫球蛋白的Fc结构域。免疫球蛋白可以是IgG，例如IgG1。在本专利技术的一个实施方案中，多价结合分子是肽二聚体，其中所述肽通过Fc结构域的内在能力二聚化或通过Fc内的杵臼(knob-in-hole)构象而二聚化，从而允许两种不同肽的特异性组装，以产生多价结合结构域。通过杵臼构象使肽二聚化的方法描述于WO2018/026942，专利技术人VanDyk等人，通过引用并入本文。如本文所述的FZD激动剂的多价结合结构域中的一者或两者可以是二价和单特异性的，对于它们各自的受体或共受体靶标的相同表位具有两个结合位点。结合结构域中的一者或两者可以是具有两个结合位点的二价和双特异性的，其中每个位点在其各自的靶标上结合不同的表位。在本专利技术的一个实施方案中，FZD结合结构域可包含两个单链可变片段(scFv)，用于结合FZD受体上的相同或不同表位。在本专利技术的其他实施方案中，FZD结合结构域包含结合FZD的一个以上的重链可变结构域(VH)片段和/或一个以上的轻链可变结构域(VL)片段。在本专利技术的其他实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种激活细胞中Wnt信号通路的方法，所述方法包括使具有卷曲蛋白(FZD)受体和Wnt共受体的细胞与多价结合分子接触，其中所述多价结合分子包含：/n(a)具有C末端和N末端的Fc结构域或其包含CH3结构域的片段，/n(b)具有至少两个结合位点的FZD结合结构域，其中至少一个结合位点结合至FZD受体和/n(c)具有至少两个结合位点的Wnt共受体结构域，其中至少一个结合位点结合至Wnt共受体，/n其中所述FZD结合结构域连接至所述Fc结构域的一末端或其片段的一末端，所述Wnt共受体结合结构域连接至所述Fc结构域的另一末端或其片段的另一末端。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180214 US 62/630,7721.一种激活细胞中Wnt信号通路的方法，所述方法包括使具有卷曲蛋白(FZD)受体和Wnt共受体的细胞与多价结合分子接触，其中所述多价结合分子包含：
(a)具有C末端和N末端的Fc结构域或其包含CH3结构域的片段，
(b)具有至少两个结合位点的FZD结合结构域，其中至少一个结合位点结合至FZD受体和
(c)具有至少两个结合位点的Wnt共受体结构域，其中至少一个结合位点结合至Wnt共受体，
其中所述FZD结合结构域连接至所述Fc结构域的一末端或其片段的一末端，所述Wnt共受体结合结构域连接至所述Fc结构域的另一末端或其片段的另一末端。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述FZD结合结构域包含：
(a)结合所述FZD受体的双体抗体，所述双体抗体包含两条肽，每条肽包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对，从而形成双体抗体，或
(b)结合所述FZD受体的包含VL和VH区的scFv，或
(c)所述FZD受体的内源性配体，和
所述Wnt共受体结合结构域包含：
(d)结合所述Wnt共受体的双体抗体，所述双体抗体包含两条肽，每条肽包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，其中来自一条肽的VH和VL与另一条肽的VL和VH配对，从而形成双体抗体，或，
(e)结合所述共受体的包含VL和VH区的scFv，或
(f)所述共受体的内源性配体或此类配体的结合所述共受体的片段。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述FZD结合结构域结合至所述FZD受体上的Wnt配体结合位点，或所述Wnt共受体结合结构域结合至所述Wnt共受体上的Wnt配体结合位点。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Wnt共受体结合结构域结合Wnt3和/或Wnt1结合位点。


5.根据权利要求3所述的方法，其中所述VH和VL源自表1中列出的多价结合分子。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述FZD结合结构域结合一个以上的FZD受体。


7.根据权利要求1所述的方法，其中所述Fc结构域是IgGFc结构域。


8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述FZD受体是FZD1、FZD2、FZD4、FZD5、FZD7或FZD8，和所述Wnt共受体是LRP5、LRP6、ROR1、ROR2、RYK、PTK7、GPR124、或TSPAN12。


9.一种多价结合分子，其中所述多价结合分子包含：
(a)具有C末端和N末端的Fc结构域或其包含CH3结构域的片段，
(b)具有至少两个结合位点的FZD结合结构域，其中至少一个结合位点结合至FZD受体，和
(c)具有至少两个结合位点的Wnt共受体结合结构域，其中至少一个结合位点结合至Wnt共受体，
其中所述FZD结合结构域连接至所述Fc结构域的一末端，和所述Wnt共受体结合结构域连接至所述Fc结构域的另一末端。


10.根据权利要求9所述的多价结合分子，其中所述FZD结合结构域包含：
(a)结合所述FZD受体的双体抗体，所述双体抗体包含两条肽，每条肽包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·安格斯，S·西杜，陶余勇，
申请(专利权)人：安托拉诊疗公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA