注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测方法，所述方法，包括以下步骤：1)样品溶液配制方法：原料样品加入已过夜冷冻的乙腈，原始样品体积与乙腈体积的比值在1～3范围内，震荡，超声2～4min，再震荡20～40s，8000～9800rpm离心1～3min，取上清液；2)标准品溶液配制方法：取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml；3)检测：分别取标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录CAD检测到的色谱图，以标准品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，用外标法计算样品溶液中泊洛沙姆的含量，经换算得到注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆的含量。

【技术实现步骤摘要】
注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测方法
本专利技术属于检测分析技术，具体涉及一种注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的测定方法。
技术介绍
注射用重组人尿激酶原(商品名，普佑克)用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治疗。注射用重组人尿激酶原的原料为重组人尿激酶原(pro-UK)，即注射用重组人尿激酶原的原液，其制备方法见200410058006.0(公开号为CN1730098A)。注射用重组人尿激酶原(Pro-UK)原料的原生产工艺是20L发酵规模，为了满足蓬勃发展的市场需求，现将工艺放大到300L发酵规模。该300L新工艺在发酵过程中会产生大量的气泡，因此在反应器的细胞培养基中新添加了普兰尼克F68(PluronicF68)，又称泊洛沙姆188(Poloxamer188)，简称F68，它可以作为消泡剂和抗击细胞培养中剪切力的细胞膜稳定剂，该化合物经过后期的纯化工艺可以被去除。根据国家法规的要求，需要对工艺过程中引入的杂质进行研究、检测和控制，因此，为了确定泊洛沙姆188对产品质量的影响，必须对产品原料中的残留水平进行研究。高效液相色谱(HPLC)方法是药品杂质残留量分析常用的检测方法，泊洛沙姆188与目的蛋白均是大分子物质，需要选择合适的色谱条件将其分离。另外，泊洛沙姆188不具有光吸收性质，也不具有荧光性质，需要选择合适的通用型检测器对其进行测定。中国专利CN101262918A(申请号为200680033079.1)公开了一种液体蛋白质样品中泊洛沙姆类的分析检测方法，具体是将分子筛析色谱柱TSKG3000PW(粒径10μm或者17μm，孔径)和示差折光检测器(RI)应用在泊洛沙姆188的检测上，蛋白质的分子量是20-70kDa之间，优选为FSH、LH、hCG、TSH的促性腺激素。该色谱柱分离效率较低，RI检测器的灵敏度不高，容易受到检测环境中温度的影响，且不能使用梯度洗脱的色谱条件。另外，该方法采用了较低pH值的流动相(pH为1.7～1.9)，对整个液相系统(包括液相管路、色谱柱、检测器)来说，长期使用会造成损伤，考虑到液相系统的pH耐受情况，一般选择的色谱条件在2～9的pH范围内。李响等在《蒸发光散射检测法测定重组人IL-12注射液中泊洛沙姆188》中报道，采用反相色谱柱PolyRP-100(粒径5μm，孔径)和蒸发光散射检测器(ELSD)检测泊洛沙姆188，IL-12是白介素，属于重组蛋白。ELSD检测器灵敏度不高，可以检测到ug级，不能检测到低于10％的物质，比较适合蛋白制品中药用辅料含量的检测，对于蛋白制品中残留物含量的检测来说，电喷雾检测器(CAD)更为适合，可以检测到ng级，可以检测到低于0.05％的杂质，另外相对于CAD检测器而言，ELSD检测器线性范围很窄(1-2个数量级)，响应一致性差，重现性不高。本专利技术用高效液相色谱(HPLC)将泊洛沙姆188与其他物质进行分离，然后用电喷雾检测器(CAD)对泊洛沙姆188进行检测。本专利技术检测原料中泊洛沙姆188的残留量，其含量很少，即便使用CAD检测器也增加了检测难度。另外，重组人尿激酶原和泊洛沙姆188均是大分子物质，难以分离，这也为HPLC色谱条件的优化增加了难度。
技术实现思路
本专利技术提供了一种注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆残留量的检测方法。本专利技术提供检测原料中泊洛沙姆188的残留量方法，包括以下步骤：1)样品溶液配制方法：原料样品加入已过夜冷冻的乙腈，原始样品体积与乙腈体积的比值在1～3范围内，震荡，超声2～4min，再震荡20～40s，8000～9800rpm离心1～3min，取上清液；2)标准品溶液配制方法：取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml；3)检测：分别取标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录CAD检测到的色谱图，以标准品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，用外标法计算样品溶液中泊洛沙姆的含量，经换算得到注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆的含量。其中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：色谱柱AcclaimTMSurfactantPluscolumn,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；梯度洗脱；UV检测器280nm；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃；梯度洗脱条件见表1：表1：梯度洗脱表时间(分钟)流动相A：100mM甲酸铵流动相B：100％乙腈梯度曲线*0.00722854.007228512.003070514.001090518.001090518.107228524.0072285备注：*梯度曲线(curve)见图11。其中，所述原料样品为任意一种其中含有微量泊洛沙姆的原料药，优选多肽类药物，更优选为通过基因重组技术生产的多肽类药物，包括已知的多种药物如，白介素类，EPO类，集落细胞刺激因子类，抗肿瘤多肽，尿激酶多肽等，最优选为重组人尿激酶原多肽原料药，该原料药为尿激酶的前体，由411个氨基酸残基组成，主要被纤溶酶和肽激酶水解，它是从人体细胞所克隆的尿激酶原，通过基因重组技术制备得到，主要用于急性ST段抬高性心肌梗死。以下为本专利技术名称术语的解释和说明：所述原始样品为注射用重组人尿激酶原原液，蛋白浓度低于50mg/mL。标准品为泊洛沙姆，简称F68，Sigma生产，批号为SLBP3447V。高效液相色谱仪采用ThermoUltimate3000，也可以选择其他品牌的具有同等功能的仪器。优选的，本专利技术提供检测原料中泊洛沙姆188的残留量方法，包括以下步骤：1)样品溶液配制方法：200μl原始样品加入300μl已过夜冷冻的乙腈，震荡30s，超声3min，再震荡30s，9500rpm转速离心1min，取上清液。2)标准品溶液配制方法：取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml。3)高效液相色谱的色谱条件如下：色谱柱AcclaimTMSurfactantPluscolumn,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种原料样品中泊洛沙姆残留量的检测方法，所述方法，包括以下步骤：/n1)样品溶液配制方法：原料样品加入已过夜冷冻的乙腈，原始样品体积与乙腈体积的比值在1～3范围内，震荡，超声2～4min，再震荡20～40s，8000～9800rpm离心1～3min，取上清液；/n2)标准品溶液配制方法：/n取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml；/n3)高效液相色谱的色谱条件如下：/n色谱柱Acclaim

【技术特征摘要】
1.一种原料样品中泊洛沙姆残留量的检测方法，所述方法，包括以下步骤：
1)样品溶液配制方法：原料样品加入已过夜冷冻的乙腈，原始样品体积与乙腈体积的比值在1～3范围内，震荡，超声2～4min，再震荡20～40s，8000～9800rpm离心1～3min，取上清液；
2)标准品溶液配制方法：
取泊洛沙姆标准品，称量并配制标准品溶液，浓度依次为2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml；
3)高效液相色谱的色谱条件如下：
色谱柱AcclaimTMSurfactantPluscolumn,3μm,30mm×150mm；进样体积10μL；柱温40℃；流速0.7mL/min；梯度洗脱；UV检测器280nm；CAD检测器：采样频率5赫兹，峰过滤时间参数3.6秒，雾化温度50℃，流动相为甲酸铵和乙腈，梯度洗脱；
4)检测：分别取标准品溶液和样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录CAD检测到的色谱图，以标准品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，用外标法计算样品溶液中泊洛沙姆的含量，经换算得到注射用重组人尿激酶原原料中泊洛沙姆的含量。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相为100nm甲酸铵和乙腈，梯度洗脱条件见下表










时间(分钟)
流动相A：100mM甲酸铵
流动相B：100％乙腈
梯度曲线*


0.00
72
28
5


4.00
72
28
5


12.00
30
70
5


14.00
10
90
5


18.00
10
90
5


18.10
72
28
5


24.0
72
28
5。








3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述原料样品为含有微量泊洛沙姆的多肽类药物。


4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述原料样品为通过...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓旭，莫英，韩进，
申请(专利权)人：天士力生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31