一种自发性肺鳞癌小鼠模型的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种自发性肺鳞癌小鼠模型的构建方法，涉及小鼠模型构建技术领域；本发明专利技术通过设计条件性Yap1敲入的打靶载体，构建条件性Yap1敲入的小鼠(Yap1

【技术实现步骤摘要】
一种自发性肺鳞癌小鼠模型的构建方法
本专利技术属于小鼠模型构建
，具体涉及一种自发性肺鳞癌小鼠模型的构建方法。
技术介绍
肺癌是目前人类第一大恶性肿瘤，其发病率和死亡率均占首位。非小细胞肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)占全部肺癌患者的85％；在NSCLC中60～80％是肺腺癌，20～40％是肺鳞癌，而对于肺癌尤其是肺鳞癌的治疗和机理研究，其动物模型必不可少。但是目前已有肺鳞癌小鼠模型，存在诸多明显缺陷，主要是：(1)自发成瘤异常缓慢，常常需要数月甚至1年，非常不利于实验研究；(2)自发肿瘤组织中病理类型不纯，同一肿瘤组织中存在多种病理亚型；(3)由于抑癌基因敲除不具有肺鳞癌发生的特异性等，缺乏引入促癌基因的动物模型的研究。因此，亟需一种更为科学合理的自发性肺鳞癌小鼠模型。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种自发性肺鳞癌小鼠模型的构建方法，构建方法简单，且构建得到的自发肺鳞癌小鼠模型，具有快速成瘤的特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种自发性肺鳞癌小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：(1)利用条件性Yap1敲入的打靶载体，构建条件性Yap1敲入的小鼠Yap1KI；(2)将所述条件性Yap1敲入的小鼠Yap1KI与Trp53基因敲除小鼠Trp53KO杂交，得Yap1KI/Trp53KO小鼠。优选的，步骤(1)所述条件性Yap1敲入的打靶载体还包括阴性筛选标记DTA和阳性筛选标记Neo。优选的，所述条件性Yap1敲入的打靶载体以KI431-basicvector为基础载体，还包括依次连接的小鼠Yap1基因、来源于人的SP-C启动子和小鼠ROSA26基因；所述SP-C启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的，所述小鼠Yap1基因的点突变位点为TCC336GCC。优选的，所述条件性Yap1敲入的打靶载体的构建方法，包括以下步骤：(a)在小鼠Yap1基因的TCC336GCC位点引入点突变，得突变Yap1基因；(b)将来源于人的SP-C启动子与所述突变Yap1基因连接，得HumanSP-Cpromoter-mutantmouseYap1CDS-ployA盒；(c)将所述HumanSP-Cpromoter-mutantmouseYap1CDS-ployA盒以相反方向克隆到ROSA26的内含子1中，得HumanSP-Cpromoter-mutantmouseYap1CDS；(d)将所述HumanSP-Cpromoter-mutantmouseYap1CDS的序列连接到所述基础载体的KpnI/PmlI酶切骨架中。优选的，步骤(1)中采用ES打靶的方法将所述条件性Yap1敲入的打靶载体敲入小鼠囊胚中。优选的，步骤(2)所述杂交为选择所述条件性Yap1敲入的小鼠Yap1KI的纯合子与Trp53KO基因敲除小鼠的纯合子同笼交配。优选的，将所述同笼交配后得到的幼崽进行PCR验证。优选的，所述PCR验证的引物包括检测Yap1的引物Neo-del-F、Neo-del-R和WT-F；检测Trp53的引物Trp53-F1、Trp53-R1和Trp53-F3；所述Neo-del-F的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述Neo-del-R的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述WT-F的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；所述Trp53-F1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，所述Trp53-R1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述Trp53-F3的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。优选的，所述PCR验证的程序包括：利用引物Neo-del-F、Neo-del-R和WT-F检测Tap1的PCR程序包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，64℃退火35s，72℃延伸35s，33循环；72℃延伸5min；利用引物Trp53-F1和Trp53-R1检测Trp53的PCR程序包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；利用引物Trp53-F3和Trp53-R1检测Trp53的PCR程序包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，70℃退火30s，72℃延伸50s，33个循环；72℃延伸10min。本专利技术提供了一种自发性肺鳞癌小鼠模型的构建方法，通过设计条件性Yap1敲入的打靶载体，构建条件性Yap1敲入的小鼠(Yap1KI)，由于Yap1的促癌作用，使自发肺鳞癌具有快速成瘤的特点，然后按照转基因小鼠的标准设计，在打靶载体中同样引入阴性筛选标记(DTA)和阳性筛选标记(Neo)，便于快速获得阳性克隆，最后利用Trp53基因敲除小鼠与Yap1KI小鼠进行杂交，最后获得Yap1KI/Trp53KO小鼠，完成自发性肺鳞癌小鼠模型的构建。附图说明图1为条件性Yap1敲入构建策略；图2为Yap1基因敲入小鼠构建过程；图3为靶向载体质粒图谱；图4为靶向ES克隆结果图；图5为用于SouthernBlot的区域选择；图6为SouthernBlot结果图；图7为Yap1突变体测序图；图8为HE染色结果图，其中从左到右依次表示Yap1KITrp53KO(肺气管)，Yap1KITrp53KO(肺叶)和对照组)；图9为免疫组化结果，其中从左到右依次表示KI67、P63和Yap1；图10为肺体积的CT实验结果。具体实施方式本专利技术提供了一种自发性肺鳞癌小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：(1)利用条件性Yap1敲入的打靶载体，构建条件性Yap1敲入的小鼠Yap1KI；(2)将所述条件性Yap1敲入的小鼠Yap1KI与Trp53基因敲除小鼠杂交，得Yap1KI/Trp53KO小鼠。本专利技术利用条件性Yap1敲入的打靶载体，构建条件性Yap1敲入的小鼠Yap1KI。本专利技术所述条件性Yap1敲入的打靶载体优选还包括阴性筛选标记DTA和阳性筛选标记Neo。本专利技术所述条件性Yap1敲入的打靶载体优选以KI431-basicvector为基础载体，还包括依次连接的小鼠Yap1基因、来源于人的SP-C启动子和小鼠ROSA26基因；所述SP-C启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示(扩增引物CF和CR，CF(SEQIDNO.8)-GGCTGTTGCGCGGGCTCCAT；CR(SEQIDNO.9)-TTAAAGTTAGTAGCGTCGACCACGTGACTAG)。本专利技术所述小鼠Yap1基因位于小鼠9号染色体上，NCBI参考序列：NM_001171147.1(扩增引物AF/AR和BF/B，AF(SEQIDNO.10)-GCAGCCTGCACCTGAGGATAATCGATCTATAACCACGTGAGAAAGCTTTCT；AR(SEQIDNO.11本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自发性肺鳞癌小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用条件性Yap1敲入的打靶载体，构建条件性Yap1敲入的小鼠Yap1

【技术特征摘要】
1.一种自发性肺鳞癌小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用条件性Yap1敲入的打靶载体，构建条件性Yap1敲入的小鼠Yap1KI；
(2)将所述条件性Yap1敲入的小鼠与Trp53基因敲除小鼠杂交，得Yap1KI/Trp53KO小鼠。


2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述条件性Yap1敲入的打靶载体还包括阴性筛选标记DTA和阳性筛选标记Neo。


3.根据权利要求2所述构建载体，其特征在于，所述条件性Yap1敲入的打靶载体以KI431-basicvector为基础载体，还包括依次连接的小鼠Yap1基因、来源于人的SP-C启动子和小鼠ROSA26基因；所述SP-C启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述小鼠Yap1基因的点突变位点为TCC336GCC。


5.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述条件性Yap1敲入的打靶载体的构建方法，包括以下步骤：(a)在小鼠Yap1基因的TCC336GCC位点引入点突变，得突变Yap1基因；
(b)将来源于人的SP-C启动子与所述突变Yap1基因连接，得HumanSP-Cpromoter-mutantmouseYap1CDS-ployA盒；
(c)将所述HumanSP-Cpromoter-mutantmouseYap1CDS-ployA盒以相反方向克隆到ROSA26的内含子1中，得HumanSP-Cpromoter-mutantmouseYap1CDS；
(d)将所述HumanSP-Cpromoter-mutantmouseYap1CDS的序列连接到所述基础载体的KpnI/PmlI酶切骨架中。


6.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙建国，李奉，孟令鑫，廖星芸，赵先兰，余永新，廖荣霞，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50