一种倍氯米松的核酸适配体及其筛选方法与应用技术

本发明专利技术首次公开了小分子倍氯米松的核酸适配体，所述适配体序列如SEQ ID NO.1～6任一项所示，或SEQ ID NO.1～6截短后的活性序列。所述适配体的筛选运用多种技术筛选倍氯米松的适配体，如文库固定、磁珠分离、Q‑PCR检测、ePCR扩增、SDS‑PAGE和高通量测序等。经过15轮筛选，共发现6个候选适配体，其中6号对倍氯米松的亲和力和特异性最好，Kd值为0.15±0.02uM。

【技术实现步骤摘要】
一种倍氯米松的核酸适配体及其筛选方法与应用
本专利技术涉及核酸适配体的筛选和应用
，更具体地，涉及一种倍氯米松的核酸适配体及其筛选方法与应用。
技术介绍
倍氯米松是一种强效的局部糖皮质激素。外用主要治疗湿疹、过敏性皮炎、神经性皮炎、接触性皮炎、牛皮癣及各种瘙痒症。倍氯米松气雾剂可用于过敏性哮喘、过敏性皮炎等疾病。副作用可引起红斑、丘疹、结痂等。因此，有必要对其质量进行研究。倍氯米松常与其他药物联合使用以进行疾病的临床治疗。Amira等利用质谱技术对倍氯米松的生物利用度进行了评价。这篇文章使用SELEX技术首次筛选到倍氯米松的适配体。适配体是一种短单链寡核苷酸，具有很强的亲和性和特异性，靶标广泛，如离子、小分子、大分子、病毒、细胞等。目前已经商业化的有两种适配体，一种是用于治疗黄斑变性的Macugen(RNA适配体)，另一种是用于检测赭曲霉素的适配体生物测定法。与抗体相比，适配体具有许多优点，主要体现在稳定性高、低或无免疫原性、易修饰性和低成本的特性。自从Ellington等人报道了第一个DNA适配体以来，适配体引起了越来越多的关注。利用SELEX从含有1014～1015个DNA或RNA序列的文库中获得适配体，主要步骤包括:文库或靶标固定、靶标洗脱、非结合文库分离、结合适配体扩增和单链制备。通常将靶标固定在固体上，如磁性微球、琼脂糖珠、氧化石墨烯等。NaQiao等,提出通过高效的化学交联方法将靶标蛋白质的氨基酸与磁珠表面活化的羧酸官能团结合以筛选适配体,该方法适用于大分子,因为小分子没有足够官能团以固定于固体表面,并且小分子靶标固定于磁珠表面将会占据的小分子的官能团而降低筛选效率。也有相关报道既不固定靶标也不固定适配体于固体表面，如ChaoZhu等，采用毛细管电泳法对牛乳铁蛋白进行适配体的筛选。洗脱是指在靶标的诱导下使适配体从固体中释放出来。分离是利用磁力或离心法将未结合的适配体与适配靶标复合物分离得到适配靶标复合物。制备单链的技术有很多，如不等长引物PCR、不对称PCR、lambda核酸外切酶消化、琼脂糖凝胶电泳等。
技术实现思路
本专利技术第一个方面的目的，在于提供一种亲和力强特异性好的倍氯米松的核酸适配体。本专利技术第二个方面的目的，在于提供上述核酸适配体的筛选方法。本专利技术第三个方面的目的，在于提供上述核酸适配体在制备倍氯米松传感器中的应用。本专利技术第四个方面的目的，在于提供一种倍氯米松检测传感器。本专利技术第五个方面的目的，在于提供上述核酸适配体在检测倍氯米松中的应用。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供一种倍氯米松的核酸适配体，所述适配体序列如SEQIDNO.1～6任一项所示，或SEQIDNO.1～6截短后的活性序列。优选地，根据本专利技术第一个方面所述的核酸适配体，所述截短后的活性序列3’末端为G碱基。进一步地，根据本专利技术第一个方面所述的核酸适配体，所述适配体序列如SEQIDNO.7～12所示。本专利技术的第二个方面，提供本专利技术第一个方面所述核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：S1.将ssDNA文库固定于磁珠表面，洗涤，得洗涤液；S2.磁珠分离：将倍氯米松加入磁珠复合物中，孵育，洗脱，得洗脱液；S3.qPCR检测：将步骤S1中洗涤液与S2中洗脱液进行qPCR检测；S4.ePCR扩大文库：将步骤S2中洗脱液的剩余部分进行ePCR，扩大文库；S5.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳制备下一轮的文库；S6.将富集的文库进行高通量测序；S7.对测序后序列进行二级结构预测，并检测适配体的亲和力与特异性，筛选出亲和力高特异性强的核酸适配体。优选地，根据本专利技术第二个方面所述的方法，步骤S1中将ssDNA文库溶解后，加入接头序列，进行梯度变性，将磁珠与变性混合物孵育后洗涤，得洗脱液。优选地，根据本专利技术第二个方面所述的方法，在步骤S2中实施反筛选，以去除非特异性适配体。优选地，根据本专利技术第二个方面所述的方法，步骤S2中，在第8轮实施反筛选。优选地，根据本专利技术第二个方面所述的方法，步骤S5中，在第13轮收集扩增产物。利用链霉亲和素-生物素法将适配体固定于磁珠表面进行筛选倍氯米松适配体。众所周知，链霉亲和素-生物素是已知亲和力最高的结合物，Kd值约为1015mol/L，其亲和力至少是抗原与抗体亲和力的1万倍。与ssDNA文库碱基互补的生物素修饰的短寡核苷酸连接链，这将影响ssDNA文库的折叠，在靶标存在的情况下，适配体与目标物结合，并从寡核苷酸连接链中释放适配体。传统的PCR由于偏好扩增，且扩增周期较长，容易产生副产物，影响高通量测序。通过qPCR的扩增曲线和保留率，进行定性和定量分析。在第13轮，由qPCR扩增曲线发生了变化，有一定程度的上升，表示文库已经富集。qPCR标准曲线如图2A所示，线性相关系数R2为0.9992。通过qPCR扩增，相关系数较大，表明Ct值与模板的对数DNA文库浓度有很好的相关性。根据标准曲线，我们计算从第十轮到第十五轮的保留率，如图2B所示，最高的保留率为第13轮，我们用荧光分光光度计在激发波长397nm、发射波长401nm处检测文库亲和力，结果第13轮的亲和力最高。因此，qPCR可以用于监测文库的富集和终止selex过程。优选地，根据本专利技术第二个方面所述的方法，步骤S7中采用荧光光谱法检测适配体的亲和力与特异性。本专利技术的第三个方面，提供本专利技术第一个方面所述的核酸适配体在制备氯米松传感器中的应用。本专利技术的第四个方面，提供一种倍氯米松检测传感器，采用序列如SEQIDNO.7～12所示的核酸适配体作为探针，检测时，核酸适配体与倍氯米松结合后，采用Qd作为信号放大检测倍氯米松的Kd值。本专利技术的第五个方面，提供本专利技术第一个方面所述的核酸适配体在检测倍氯米松中的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术首次筛选出小分子倍氯米松的核酸适配体，并根据倍氯米松的天然荧光特性，通过荧光光谱对6号进行了表征。本次筛选运用多种技术筛选倍氯米松的适配体，如文库固定、磁珠分离、Q-PCR检测、ePCR扩增、SDS-PAGE和高通量测序等。这些技术可以简单而快速的筛选到适配体，经过15轮筛选，共发现6个候选适配体，其中6号对倍氯米松的亲和力和特异性最好，Kd值为0.15±0.02uM。本专利技术通过链霉亲和素修饰磁珠和文库互补的生物素修饰的短核苷酸链，使文库固定在磁珠上。在倍氯米松的存在下，高亲和力的适配体从短核苷酸链连接链释放出，磁力将磁珠拉到底部，上清液中高亲和力的适配体经过扩增作为下一轮筛选文库。然而，传统的聚合酶链反应(PCR)可能会产生副产物，在此，专利技术人选择使用乳浊液聚合酶链反应(ePCR)可以缓解偏好扩增现象。本专利技术使用实时定量PCR(real-timequantitativePCR,QPCR)和共振瑞利散射(ResonanceRayleigh,RRS)来监测筛选过程，并确定终止selex的最佳循环周期，并采用不等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种倍氯米松的核酸适配体，其特征在于，所述适配体序列如SEQ ID NO.1～6任一项所示，或SEQ ID NO.1～6截短后的活性序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种倍氯米松的核酸适配体，其特征在于，所述适配体序列如SEQIDNO.1～6任一项所示，或SEQIDNO.1～6截短后的活性序列。


2.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述截短后的活性序列3’末端为G碱基。


3.根据权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述适配体序列如SEQIDNO.7～12所示。


4.权利要求1至3任一项所述核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
S1.将ssDNA文库固定于磁珠表面，洗涤，得洗涤液；
S2.磁珠分离：将倍氯米松加入磁珠复合物中，孵育，洗脱，得洗脱液；
S3.qPCR检测：将步骤S1中洗涤液与S2中洗脱液进行qPCR检测；
S4.ePCR扩大文库：将步骤S2中洗脱液的剩余部分进行ePCR，扩大文库；
S5.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳制备下一轮的文库；
S6.将富集的文库进行高通量测序；
S7.对测序后序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗卓雅，樊洪利，刘亚雄，董嘉媚，
申请(专利权)人：广东省药品检验所广东省药品质量研究所，广东省口岸药品检验所，
类型：发明
国别省市：广东;44