一种高粱原生质体的制备方法及瞬时表达转化的方法技术

本发明专利技术公开了一种以高粱BTx623幼苗为材料，以酶解法获得大量高粱原生质体及使用聚乙二醇介导法对高粱原生质体进行转化的方法。具体步骤包括：一、挑选饱满的高粱种子，消毒后种于培养基中；二、选取生长良好的高粱幼苗，去除叶和根，保留中间叶鞘部分，用刀片切成细条，在甘露醇溶液中预处理后加入酶解液进行酶解；三、酶解结束后，利用离心法富集原生质体，并重悬；四、利用聚乙二醇介导法转化所得原生质体。本发明专利技术建立了稳定高效的高粱原生质体分离及转化体系，该方法快速高效、转化率高，能够用于目的基因表达、蛋白质亚细胞定位和蛋白质互作等，为高粱的遗传改良和基因功能组研究提供了一个有力的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种高粱原生质体的制备方法及瞬时表达转化的方法
本专利技术涉及一种高梁原生质体的制备方法及制备的原生质体的转化方法。
技术介绍
高粱是一年生禾本科C4植物，可作为食用、饲用、酿造和生物能源等方面，具有广泛的适应性和良好的抗逆性，在全世界和我国各地均广泛种植，具有较高的经济价值和研究价值。然而高粱存在转化难、再生难等问题，利用常规遗传转化技术对其进行转化，如农杆菌侵染法，存在效率低、再生难和周期长等难点，限制了高粱的遗传改良和功能基因组研究的发展。植物原生质体是植物细胞去除细胞壁后裸露的细胞，具有容易摄取外源核酸片段的特性。自1960年Cocking等首次利用纤维素酶粗制剂，从番茄根尖中分离出大量的原生质体以来，多种植物如拟南芥、水稻、玉米、烟草等都建立了原生质体分离系统。植物瞬时表达是一种将目标基因转入靶细胞，并在短时间内使外源基因高效表达的技术。；利用原生质体易于摄取外源基因的特性，为植物瞬时表达技术的应用提供了良好的实验系统。在植物原生质体中进行瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到靶细胞基因组中，被广泛应用于蛋白的亚细胞定位、基因瞬时表达、蛋白质互作、启动子活性等多种植物基因功能研究中。目前高粱缺少稳定高效的原生质体瞬时表达体系，因此建立高粱原生质体制备及转化体系对高粱的遗传转化、基因功能研究是具有重要意义的。本专利技术利用高粱幼苗成功建立了稳定、高效、快速的高粱原生质体瞬时表达体系，克服了高粱难以转化的问题，为在高粱中进行遗传育种和基因功能组研究提供了一个有力的工具。
技术实现思路
<br>本专利技术的目的是提供一种高粱原生质体的制备方法。为此，本专利技术提供的技术方案为：一种高粱原生质体的制备方法，包括如下步骤：（1）挑选饱满的高粱种子消毒后接种于MS培养基中，移至组培室中培养；（2）选取步骤（1）中培养良好的幼苗，取其中间叶鞘部分，用刀片迅速切成条状，放入装有甘露醇溶液的容器中进行预处理；（3）移除甘露醇，加入酶解液，避光，置于摇床上低速震荡，真空处理20-90min后继续酶解高粱材料；（4）酶解结束后，对高粱原生质体进行分离纯化，得到高活力的高粱原生质体。步骤（2）中所述甘露醇溶液预处理为：在切成细条的高粱材料中加入0.5-0.7M的甘露醇溶液，避光，质壁分离20-30min。步骤（3）中所述酶解液的配置方法为：称取甘露醇、纤维素酶和离析酶，加入吗啉乙磺酸溶液及双蒸水，在50-55℃水浴锅中孵育后冷却到室温，经过滤再加入CaCl2溶液、β-巯基乙醇和小牛血清蛋白即可得到酶解液。所述酶解液中各组分的最终浓度为：甘露醇0.5-0.7M、纤维素酶0.5-2wt%、离析酶0.15-0.75wt%、吗啉乙磺酸8-12mM、CaCl20.5-3mM、β-巯基乙醇3-8mM、小牛血清蛋白0.05-0.2wt%。所述原生质体分离包括如下步骤：将酶解液用200目的尼龙网初步过滤，将收集的滤液在2-4℃下、离心，移除上清，用W5溶液重悬原生质体即可。W5溶液中包括吗啉乙磺酸、NaCl、KCl、CaCl2、双蒸水；其最终浓度分别为吗啉乙磺酸2-3mM、NaCl150-160mM、KCl2-8mM、CaCl2120-130mM。本专利技术的又一技术方案是将制备得到的高粱原生质体进行原生质体转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在离心管中加入质粒和原生质体，再加入PEG-Ca溶液，吸打混匀，室温、避光、静置孵育；（2）加入W5溶液，吸打混匀，终止转化，即得转化子。所述的PEG-Ca溶液包括甘露醇、聚乙二醇、CaCl2、双蒸水；其中最终浓度为甘露醇0.3-0.8M、聚乙二醇25-50wt%、CaCl280-120mM。所述的W5溶液中包括吗啉乙磺酸、NaCl、KCl、CaCl2、双蒸水；其最终浓度分别为吗啉乙磺酸2-3mM、NaCl150-160mM、KCl3-8mM、CaCl2120-130mM。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术建立并优化了高粱原生质体瞬时表达体系，该方法简单、快速、高效，所制备原生质体的浓度可达到107个/ml，活力在90%以上，转化率可达到60%以上，能用于蛋白质的亚细胞定位、蛋白质互作和启动子活性分析等植物功能基因组的研究。附图说明图1组织培养12天的高粱幼苗。图2将高粱幼苗的茎切成细条状。图3将切好的高粱材料移入三角瓶中并加入酶解液。图4实施例3的原生质体活力检测（A为明场，B为荧光比例尺=75μm）。图5实施例4的原生质体活力检测（A为明场，B为荧光比例尺=75μm）。图6实施例5的原生质体活力检测（A为明场，B为荧光比例尺=75μm）。图7实施例6的原生质体活力检测（A为明场，B为荧光比例尺=75μm）。图8实施例8中荧光显微镜下检查原生质体的转化率（A为明场，B为荧光，C为明场与荧光的叠加，比例尺=75μm）。图9实施例9中荧光显微镜下检查原生质体的转化率（A为明场，B为荧光，C为明场与荧光的叠加，比例尺=75μm）。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。实施例1、高粱种子的消毒和培育挑选饱满干净的高粱种子，置于干净的玻璃瓶中，加少量洗洁精，自来水流水冲洗1h，转入无菌超净工作台，用75%酒精消毒2min，无菌水清洗2次，每次1min，用0.1%的升汞（含0.1%吐温-20）浸泡消毒20min，无菌水清洗5次，每次约2min，尽量将种子上的生汞残留清洗干净，清洗完成后将种子接种到含有1/2MS培养基的玻璃瓶中，移至组织培养室，26℃每日光照16h培养12天备用（图1）。1/2MS培养基（1L）：1/2MS粉末、蔗糖3%、Agar1%、pH值5.8。实施例2、质粒（35S：：GFP）大提本专利技术使用的质粒采用QIAGENPlasmidMidiKit试剂盒提取和纯化，具体方法如下：将大肠杆菌DH5α（含构建好的载体）在含卡那霉素的LB培养基上划线涂板，37℃静置培养过夜。取3mlLB培养基（含卡那霉素）到10ml离心管中，挑取A步骤中的单菌落到离心管中，37℃220rpm震荡培养过夜。吸取1ml菌液到250mlLB培养基（含卡那霉素）中，37℃220rpm震荡培养过夜。取培养好的菌液（OD值=2-4），4℃6000×g离心15min，去上清，加10mlP1（含RNaseA100μg/ml）溶液让菌体重悬，用移液枪吸打溶液，直到菌块均匀溶解于P1溶液为止。加10mlP2溶液，轻轻上下颠倒4-6次，室温静置5min，此时溶液变得澄清。加10ml已在4℃中预冷的P3溶液，轻轻颠倒4-6次，此时出现大量白色沉淀，冰上静置20min后于4℃温度下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高粱原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）挑选饱满的高粱种子消毒后接种于MS培养基中，移至组培室中培养；/n（2）选取步骤（1）中培养良好的幼苗，取其中间叶鞘部分，用刀片切成条状，放入装有甘露醇溶液的容器中进行预处理；/n（3）移除甘露醇，加入酶解液，避光，置于摇床上低速震荡，真空处理20-90 min后继续酶解高粱材料；/n（4）酶解结束后，对高粱原生质体进行分离纯化，得到高活力的高粱原生质体。/n

【技术特征摘要】
1.一种高粱原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）挑选饱满的高粱种子消毒后接种于MS培养基中，移至组培室中培养；
（2）选取步骤（1）中培养良好的幼苗，取其中间叶鞘部分，用刀片切成条状，放入装有甘露醇溶液的容器中进行预处理；
（3）移除甘露醇，加入酶解液，避光，置于摇床上低速震荡，真空处理20-90min后继续酶解高粱材料；
（4）酶解结束后，对高粱原生质体进行分离纯化，得到高活力的高粱原生质体。


2.根据权利要求1所述的高粱原生质体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述甘露醇溶液预处理为：在切成细条的高粱材料中加入0.5-0.7M的甘露醇溶液，避光，质壁分离20-30min。


3.根据权利要求1所述的高粱原生质体的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述酶解液的配置方法为：称取甘露醇、纤维素酶和离析酶，加入吗啉乙磺酸溶液及双蒸水，在50-55℃水浴锅中孵育后冷却到室温，经过滤再加入CaCl2溶液、β-巯基乙醇和小牛血清蛋白即可得到酶解液。


4.根据权利要求3所述的高粱原生质体的制备方法，其特征在于，所述酶解液中各组分的最终浓度为：甘露醇0.5-0.7M、纤维素酶0.5-2wt%、离析酶0.15-0.75wt%、吗啉乙磺酸8-12mM、CaCl20.5-3mM、β-巯基乙醇3-8mM、小牛血清蛋白0.05-0.2wt%。
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【专利技术属性】
技术研发人员：沈祥陵，曾弓剑，陆业磊，周超，张德春，吕阳，韩少鹏，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42