本发明专利技术公开了一种体外抑制食蟹猴疟原虫生长的抗体，属于寄生虫学与免疫学领域。所述的抗体由PvMSP8+1重组蛋白制备，所述的PvMSP8+1重组蛋白为间日疟原虫裂殖子表面蛋白8(PvMSP8)和1的C末端(PvMSP1‑19)组成的融合蛋白。在体外生长抑制试验中，PvMSP8+1抗体显示出了比PvMSP8和PvMSP1‑19单抗原抗体更为优越的抑制效果。这为人们在研制多抗原疟疾疫苗时提供了一定的科学依据，具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种体外抑制食蟹猴疟原虫生长的抗体
本专利技术涉及一种体外抑制食蟹猴疟原虫生长的抗体，属于寄生虫学与免疫学领域。
技术介绍
疟疾是由按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病，其严重影响着人类的生命健康。疟疾患者往往会出现周期性的寒战、发热和出汗退热三个阶段，患者继之会出现贫血和脾肿大等相关并发症，严重者会引发凶险型疟疾甚至导致死亡，不仅对人体造成严重的身心损害，也加重了全球的经济负担。疟疾主要有疟原虫感染引起，能够感染人类的疟原虫共有5种，其中间日疟原虫是除非洲地区外分布最广的疟原虫，致病性也较为严重。由于疟原虫的变异性和抗药性的出现，研发一种多抗原疫苗以提高单抗原疫苗的效力已成为亟待解决的关键问题，并且间日疟原虫不可以在体外长期培养，这严重限制了对于间日疟原虫的研究。
技术实现思路
因此本专利技术将间日疟原虫裂殖子表面蛋白8(PvMSP8)的碳末端和1的碳末端(PvMSP1-19)融合成为一种新型嵌合蛋白PvMSP8+1。本专利技术中所使用的食蟹猴疟原虫(P.cynomolgi)是间日疟原虫的姊妹分类群，具有相似的表型，生物学和遗传特征，因此是研究间日疟原虫的理想体外模型。因此选择食蟹猴疟原虫作体外研究模型以评估PvMSP8+1特异性抗体抑制疟原虫生长的能力有着非常重要的意义，也可以为人们在研制血液阶段疟疾疫苗时提供一定的科学依据。本专利技术提供了一种用于制备体外抑制疟原虫生长的抗体的抗原，所述抗原为由间日疟原虫裂殖子表面蛋白8(GeneID:5472441)的部分C末端(PvMSP8)和间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的C末端19kDa部分通过中间连接肽融合而成在本专利技术的一种实施方式中，所述间日疟原虫裂殖子表面蛋白8的GeneID为5472441；所述间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的GeneID为5474133。在本专利技术的一种实施方式中，所述中间连接肽的氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述抗原的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了表达所述抗原的载体，所述载体优选pET32a(+)。本专利技术提供了一种表达所述抗原的微生物细胞，所述微生物细胞优选为E.coliBL21(DE3)。本专利技术提供了所述抗原制备得到的抗体。本专利技术提供了所述抗原或抗体在制备抑制疟原虫生长的产品中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述产品可降低血液中疟原虫的数量。在本专利技术的一种实施方式中，所述疟原虫为间日疟原虫。在本专利技术的一种实施方式中，所述产品包括药物或药物组合物。在本专利技术的一种实施方式中，所述药物或药物组合物还包括药学上可接受的赋型剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。本专利技术的有益效果：本专利技术通过体外生长抑制试验检测PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫体外生长的抑制效果。在体外生长抑制试验中，PvMSP8+1抗体显示出了比PvMSP8和PvMSP1-19单抗原抗体更为优越的抑制效果，IC50值为0.9459ug/mL。这为人们在研制多抗原疟疾疫苗时提供了一定的科学依据，具有广阔的应用前景。附图说明图1为PvMSP1-19蛋白考马斯亮蓝染色示意图(A)和Westernblotting检测图(B)；M为蛋白分子量标准；图2为间接免疫荧光法(IFA)检测PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫裂殖子表面MSP8和MSP1-19天然蛋白的识别图；图3为体外抑制试验验证PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫的生长抑制效率。具体实施方式原核表达质粒pET32a(+)、宿主菌BL21(DE3)及诱导用的IPTG均购自北京全式金生物科技有限公司。基因的合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成。琼脂糖亲和介质镍柱(Ni)购自QIAGEN公司。His-Taq标签抗体购自CellSignalingTechnology公司。实施例1：PvMSP8+1特异性抗体的制备重组载体的构建：根据SEQIDNO：1序列信息特异性合成PvMSP8+1基因片段并将其构建至pET32a(+)表达载体中，获得pET32a-PvMSP8+1重组质粒。蛋白表达与纯化：将pET32a-PvMSP8+1重组质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达细胞中，培养、测序，获得测序正确的阳性转化子BL21-PvMSP8+1，挑选单克隆接种5ml含氨苄霉素的LB培养基，37℃培养过夜，将菌液接种于新鲜500ml含氨苄霉素的LB培养基中，培养至OD600为0.6-0.8时，加入反应体系终浓度为1mmol/LIPTG，诱导8h。取诱导的菌株PvMSP8+1进行超声破碎裂解，经10％SDS-PAGE电泳分析表明PvMSP8+1蛋白主要定位于包涵体中，分子量大小与预期相符。通过8M尿素溶解包涵体释放PvMSP8+1蛋白，该蛋白在碳末端带有His-tag标签，因此采用GE公司的His-tag镍柱，按试剂盒说明书进行Ni2+亲和色谱纯化。用不同浓度的咪唑将蛋白提纯，咪唑的浓度分别为20mM、50mM、100mM、150mM和250mM，150mM咪唑洗下的蛋白经12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色验证分析。并进一步用WesternBlot分析目的蛋白纯度。考马斯亮蓝染色结果显示所得纯化产物为目的蛋白，分子量大小与预期相符(图1A)。WesternBlot结果显示所表达蛋白的纯度较高、特异性强(图1B)。实施例2：PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫裂殖子表面蛋白的特异性识别间接免疫荧光(IFA)法检测PvMSP8+1特异性抗体对食蟹猴疟原虫裂殖子表面蛋白的特异性识别富集裂殖体阶段的疟原虫通过Percoll梯度离心纯化，点样到多孔载玻片上，在冰冷的丙酮中固定3分钟，风干。用含有5％脱脂奶粉的PBS在37℃下封闭非特异性结合位点30分钟。将载玻片与1：100稀释PvMSP8+1特异性抗体在37℃孵育1小时。用预冷的PBS洗涤3次后，将玻片用AlexaFluor546偶联的山羊抗兔IgG二抗染色，细胞核用DAPI(Invitrogen)在37℃下孵育30分钟。将载玻片用ProLongGoldAntifade试剂(Invitrogen)中的盖玻片固定，并使用配备60倍油镜的共聚焦激光扫描FV200显微镜在油浸下观察拍照。使用FV10-ASWv.3.0查看器软件(Olympus)捕获图像，并准备使用AdobePhotoshopCS5进行编辑发布。结果如图2所示，明场显微镜下可以观察到完整的裂殖子，在A组合B组均可观察到细胞核，但仅A组可以染到裂殖子表面蛋白，而在B组无法染到裂殖子表面蛋白，说明而免疫前的血清无法识别本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于制备体外抑制疟原虫生长的抗体的抗原，其特征在于，所述抗原由间日疟原虫裂殖子表面蛋白8的部分C末端和间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的C末端19kDa部分通过中间连接肽融合而成；/n所述间日疟原虫裂殖子表面蛋白8的Gene ID为5472441；所述间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的Gene ID为5474133。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于制备体外抑制疟原虫生长的抗体的抗原，其特征在于，所述抗原由间日疟原虫裂殖子表面蛋白8的部分C末端和间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的C末端19kDa部分通过中间连接肽融合而成；
所述间日疟原虫裂殖子表面蛋白8的GeneID为5472441；所述间日疟原虫裂殖子表面蛋白1的GeneID为5474133。
2.根据权利要求1所述的抗原，其特征在于，所述中间连接肽的氨基酸序列为：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。
3.根据权利要求1所述的抗原，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
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【专利技术属性】
技术研发人员：程洋，沈飞虎，付海田，雷瑶，陆佳晨，杨博，徐琴雯，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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