一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种球形孢子丝菌Gp70(Glycoprotein 70)重组蛋白的制备方法及其应用，通过提取球形孢子丝菌总RNA，利用反转录PCR获得cDNA，利用特异性引物扩增得到球形孢子丝菌糖蛋白70(Gp70)基因全长序列，运用分子生物学方法进行基因片段的体外重组并制备基因片段对应的重组蛋白，将该重组蛋白应用于家兔可制备出相应的抗体，该抗体可用于制备对球形孢子丝菌感染早期快速诊断产品。本案构建了球形孢子丝菌Gp70重组蛋白原核表达体系，通过诱导可以快速大量表达；利用Ni亲和层析柱一步完成纯化，纯化过程简单快捷；免疫动物制备高效价多克隆抗体，所制备的抗体与目的蛋白具有良好的反应特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法及其应用
本专利技术涉及重组蛋白制备领域。更具体地说，本专利技术涉及一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法及其应用。
技术介绍
孢子丝菌病(sporotrichosis)是由双相型暗色真菌申克孢子丝菌(Sporothrixschenckiisensulato，下文简称Ss.)感染引起的最常见的深部真菌病。Ss.在环境中为菌丝相，寄生或腐生于植物或土壤中；而感染机体后，病灶中为酵母相。Ss.感染可形成难以自愈的慢性感染，不仅累及皮肤，也可通过淋巴管途径感染脏器，发生播散的、系统的致命性感染。我国东北三省是该病全球流行最为严重的地区之一。早期人们认为申克孢子丝菌为单一物种，但随着研究的深入，Marimon等将Ss.确定为6个种的复合体，包括狭义申克孢子丝菌(S.schenckiisensustricto)、球形孢子丝菌(S.globosa)、巴西孢子丝菌(S.brasilienis)、卢艾里孢子丝菌(S.luriei,formlynamedS.var.luriei)、墨西哥孢子丝菌(S.mexicana)和苍白球孢子丝菌(S.pallida,synonymyS.albicans)，其中，球形孢子丝菌(呈全球性分布)、申克孢子丝菌(主要分布于美国、阿根廷、巴西、秘鲁等美洲国家)和巴西孢子丝菌(主要分布于巴西地区)为常见致病菌。对于我国流行的菌株，绝大多数基因分型研究发现基本上均为球形孢子丝菌。目前该病的诊断主要依靠皮肤组织病理检查和真菌培养的联合应用。病理检查需经过标本固定、包埋、制片、染色等数个耗时步骤，患者需等待5-7天，方可得到结果，然而如病理切片并未显示星状体、阳性孢子等典型的病理改变，尚无法诊断该病，则需联合真菌培养进行诊断。真菌培养同样需以病变组织为样品，而培养结果需等待7-14天，耗时更长，同时真菌生长受环境影响程度较大，当环境温度、湿度等各方面不适宜时，则不易生长，因此阳性率无法达到我们所需求的理想程度。另外，上述两种方法均为有创检查，术后伤口愈合会遗留疤痕，对于儿童患者及面部感染患者并非理想的检测手段。如上所述，真菌培养和病理诊断均耗时较长，并且医疗机构需具备较高的实验条件和专业的技术人员，在基层医院无法开展，只能凭借医生的临床经验予以治疗。目前的研究表明，孢子丝菌感染人体或动物后，其抗原可刺激机体产生抗体，此种抗原-抗体反应可作为开发体外诊断试剂的依据。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的一个目的是提供一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法及其应用。本专利技术旨在通过提取球形孢子丝菌总RNA，利用反转录PCR获得cDNA，利用特异性引物扩增得到球形孢子丝菌糖蛋白70(Gp70)基因全长序列，运用分子生物学方法进行基因片段的体外重组并制备基因片段对应的重组蛋白，将该重组蛋白应用于家兔可制备出相应的抗体，该抗体可用于制备对球形孢子丝菌感染早期快速诊断产品。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，本专利技术提供了一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其包括以下步骤：S1：人工合成球形孢子丝菌Gp70基因序列，并在其中引入NdeI酶切位点、HindIII酶切位点、His标签和终止子；S2：对S1中人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列进行验证，以判断合成的基因序列是否为预期序列；S3：将球形孢子丝菌Gp70基因序列与pET-30a质粒进行连接反应，构建出表达质粒；S4：对所述表达质粒进行扩增；S5：对S4扩增后的质粒进行诱导表达；S6：对S5诱导表达后的产物进行纯化，得到球形孢子丝菌Gp70重组蛋白。优选的是，所述的球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其中，S2中对人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列进行验证的方法为：以pUC57质粒为载体，制得重组质粒pUC57/Gp70；于含有Amp(磷酸腺苷)的LB培养基的琼脂平板挑取含质粒pUC57/Gp70的DH5α单菌落，接种于含有Amp的LB液体培养基，在37℃下200rpm培养过夜；按照全式金质粒提取试剂盒的说明书操作提取质粒；加入pH8.0的TE缓冲液溶解沉淀；紫外分光光度计测吸光度A值，计算质粒浓度；对获得的质粒进行双酶切，双酶切体系如下：30℃酶切3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用全式金凝胶回收试剂盒回收DNA片段；根据球形孢子丝菌Gp70基因序列设计引物，上游引物为5’-CATATGGCTATATACGTAGCATCAAAC-3’；下游引物为5’-AAGCTTTCATTAGTGGTGGTGGTG-3’；对DNA片段扩增，扩增后的产物进行测序，确定人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列是否为预期序列。优选的是，所述的球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其中，S3中连接反应具体为：pET-30a质粒经NdeI和HindIII双酶切回收载体片段，随后与球形孢子丝菌Gp70基因序列进行连接反应，条件如下：加水至终体积为25u1，混匀，16℃反应过夜，反应结束加入乙酸钠、冷无水乙醇，-20℃放置60min；离心收集沉淀，用70％的冷乙醇沉淀，真空干燥，TE缓冲液溶解，得到表达质粒。优选的是，所述的球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其中，S4中，对所述表达质粒进行扩增，具体为：从37℃培养20h的LB平板中挑取大肠杆菌E.coliDH5α单个菌落，转入烧瓶中，于37℃，220rpm，震荡培养3h；随后转至用冰预冷的离心管中，置于冰上直至培养物冷却到0℃；4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；以冰预冷的CaCl2重悬沉淀，置于冰上；取上述细胞，加入S3得到的表达质粒，轻搅混匀，冰浴30min；42℃水浴90s，置冰浴上1min；加入LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养45min；取培养液涂布于含100μg/mL青霉素的LB固体培养基，37℃培养；挑取单个菌落接种于含100μg/mL青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡过夜；提取质粒进行双酶切鉴定，得到重组质粒。优选的是，所述的球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其中，S5中，对S4扩增后的质粒进行诱导表达，具体为：将经过双酶切鉴定的重组质粒转化至大肠杆菌BL21菌株，制得带有重组质粒的宿主菌BL21；挑取单菌落，接种于含Amp浓度100μg/mL，2×YT液体培养基中，200rpm37℃培养至OD600为0.6；然后将带有重组质粒的宿主菌BL21，按1％的浓度接种2×YT培养基，Amp浓度100μg/mL；按上述方法扩大培养至1L，37℃振荡培养至菌液的OD600为1.0，接IPTG至终浓度为0.8mM。优选的是，所述的球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其中，S6中，对S5诱导表达后的产物进行纯化，具体为：将诱导表达后的产物离心，收集菌体，按每毫升培养物加入25μL去离子水的比例重悬细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：人工合成球形孢子丝菌Gp70基因序列，并在其中引入Nde I酶切位点、Hind III酶切位点、His标签和终止子；/nS2：对S1中人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列进行验证，以判断合成的基因序列是否为预期序列；/nS3：将球形孢子丝菌Gp70基因序列与pET-30a质粒进行连接反应，构建出表达质粒；/nS4：对所述表达质粒进行扩增；/nS5：对S4扩增后的质粒进行诱导表达；/nS6：对S5诱导表达后的产物进行纯化，得到球形孢子丝菌Gp70重组蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：人工合成球形孢子丝菌Gp70基因序列，并在其中引入NdeI酶切位点、HindIII酶切位点、His标签和终止子；
S2：对S1中人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列进行验证，以判断合成的基因序列是否为预期序列；
S3：将球形孢子丝菌Gp70基因序列与pET-30a质粒进行连接反应，构建出表达质粒；
S4：对所述表达质粒进行扩增；
S5：对S4扩增后的质粒进行诱导表达；
S6：对S5诱导表达后的产物进行纯化，得到球形孢子丝菌Gp70重组蛋白。


2.如权利要求1所述的球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其特征在于，S2中对人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列进行验证的方法为：
以pUC57质粒为载体，制得重组质粒pUC57/Gp70；
于含有Amp的LB培养基的琼脂平板挑取含质粒pUC57/Gp70的DH5α单菌落，接种于含有Amp的LB液体培养基，在37℃下200rpm培养过夜；按照全式金质粒提取试剂盒的说明书操作提取质粒；加入pH8.0的TE缓冲液溶解沉淀；紫外分光光度计测吸光度A值，计算质粒浓度；对获得的质粒进行双酶切，双酶切体系如下：



30℃酶切3h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用全式金凝胶回收试剂盒回收DNA片段；
根据球形孢子丝菌Gp70基因序列设计引物，上游引物为5’-CATATGGCTATATACGTAGCATCAAAC-3’；下游引物为5’-AAGCTTTCATTAGTGGTGGTGGTG-3’；对DNA片段扩增，扩增后的产物进行测序，确定人工合成的球形孢子丝菌Gp70基因序列是否为预期序列。


3.如权利要求1所述的球形孢子丝菌Gp70重组蛋白的制备方法，其特征在于，S3中连接反应具体为：
pET-30a质粒经NdeI和HindIII双酶切回收载体片段，随后与球形孢子丝菌Gp70基因序列进行连接反应，条件如下：



加水至终体积为25u1，混匀，16℃反应过夜，反应结束加入乙酸钠、冷无水乙醇，-20℃放置60min；离心收集沉淀，用70％的冷乙醇沉淀，真空干燥，TE缓冲液溶解，得到表达质粒。


4.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李珊山，崔岩，姚蕾，周俊峰，尹焕才，田晶晶，
申请(专利权)人：吉林大学第一医院，
类型：发明
国别省市：吉林;22