野生型气肿疽梭菌细胞毒素A及其制备方法、应用和疫苗技术

本发明专利技术提供了一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A及其制备方法、应用和疫苗，涉及生物技术领域，本发明专利技术提供的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，采用革兰氏阳性菌分泌表达系统，能够将野生型气肿疽梭菌细胞毒素A分泌表达到培养基中，且表达量高、蛋白纯度高，无需额外去除内毒素的步骤。同时，本发明专利技术提供的制备方法还具有工艺简单、成本低、过程可控的优点。

【技术实现步骤摘要】
野生型气肿疽梭菌细胞毒素A及其制备方法、应用和疫苗
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A及其制备方法、应用和疫苗。
技术介绍
气肿疽梭状芽孢杆菌是引起牛羊等反刍动物急性、热性、败血性传染病的主要病原，主要特征是在腹部、臀部、腰部以及肩部等肌肉丰满的部位发生与恶性水肿相似的炎性气性水肿，又称“黑腿病”。该病病程短，发病急，往往来不及救治就突然死亡。为此，疫苗接种是防控该病的主要手段，而商品化的气肿疽疫苗主要是气肿疽梭菌C54-1和C54-2两株菌种接种适宜培养基，严格厌氧培养后加入甲醛灭活，再与氢氧化铝胶佐剂混合制成的灭活疫苗。该疫苗在预防气肿疽梭菌感染取得了一定的效果，但疫苗在使用和生过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应，注射剂量大，5ml；其在制备过程中涉及厌气肉肝汤制备，由于培养基成分复杂，导致培养基批间差异大和杂质多；还有气肿疽梭菌的灭活，存在菌株外泄或灭活不彻底等生物安全隐患。随着科学研究的深入，提取气肿疽梭菌培养物上清作为抗原能够完全抵抗气肿疽梭菌感染，因此鉴定上清中保护性抗原是非常必要(Micalizzi,B.andM.S.D.G.Ana,ImmunogenicityofanExtractofClostridiumchauvoeiinGuineaPigs.ClinicalInfectiousDiseases,1997.25(s2):p.S171-S172)。2012年，Joachim等人发现了气肿疽梭菌的一种新型毒素，命名为气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)，是主要的毒力因子和保护抗原(Frey,J.,etal.,CytotoxinCctA,amajorvirμlencefactorofClostridiumchauvoeiconferringprotectiveimmunityagainstmyonecrosis.Vaccine,2012.30(37):p.5500-5505.)。因此气肿疽梭菌细胞毒素A的制备是未来的发展方向。但是目前报道的表达CctA蛋白所用的系统全是采用大肠杆菌表达系统。虽然大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低和易于大规模培养等优点，是最常用、最经济的外源蛋白表达系统。但是其表达的外源蛋白通常在胞内以不可溶性的包涵体或胞内的可溶性蛋白表达，包涵体不具有生物活性，需进行变性、复性处理；胞内的可溶性蛋白具有生物活性，但含杂蛋白较多，需进行复杂的纯化过程们；由于大肠杆菌是阴性菌，含有大量的LPS(内毒素)，造成疫苗副反应，因此疫苗生产中需要去除内毒素，但是其内毒素的去除工艺复杂，生产成本高，目前是兽用生物制品生产中的难点。如一种无毒性气肿疽梭菌基因工程亚单位疫苗用菌种及其应用(申请号CN201910426739.1)和Frey,J.,etal.,CytotoxinCctA,amajorvirμlencefactorofClostridiumchauvoeiconferringprotectiveimmunityagainstmyonecrosis.Vaccine,2012.30(37):p.5500-5505.这些报道中，均采用IPTG作为诱导剂在大肠杆菌系统中表达，需要检测重组菌的生长情况添加诱导剂，CctA重组蛋白均在胞内表达，绝大部分是以包涵体存在，少部分是可溶蛋白，但是需要进行超声破碎、离心及镍柱纯化、置换洗脱液等复杂的过程。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。本专利技术的第二个目的在于提供应用上述的制备方法制备得到的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。本专利技术的第三个目的在于提供一种生物材料，包括上述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。本专利技术的第四个目的在于提供上述的制备方法或野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或生物材料在制备气肿疽梭菌疫苗、气肿疽梭菌诊断抗原或气肿疽梭菌单克隆抗体中的应用。本专利技术的第五个目的在于提供一种气肿疽梭菌疫苗，包括上述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或生物材料。本专利技术提供了一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，包括在革兰氏阳性菌表达系统中表达编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因，得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。进一步地，编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；优选地，所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。进一步地，将编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因导入pYL质粒中，提取阳性克隆质粒经RN4220转化后，将构建的质粒电击转化进入革兰氏阳性菌表达系统中，得到表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的重组微生物后，还包括对所述重组微生物进行培养的步骤，然后通过对重组微生物的诱导表达得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。进一步地，所述革兰氏阳性菌表达系统包括如下(a)-(d)中的任一种:(a)表皮葡萄球菌表达系统；(b)枯草芽孢杆菌表达系统；(c)谷氨酸棒状杆菌表达系统；(d)乳酸杆菌表达系统。进一步地，所述革兰氏阳性菌表达系统为表皮葡萄球菌表达系统；优选地，所述重组微生物为重组表皮葡萄球菌株SE/pYL-CctA；优选地，所述诱导表达的条件包括使用终浓度为300～700ng/mL的诱导剂ATC在35℃～40℃诱导16～36小时；优选地，所述诱导表达的条件包括使用终浓度为500ng/mL的诱导剂ATC在37℃诱导24小时；优选地，种子液接种量0.1～5％(v/v)，优选为1％(v/v)；优选地，补料碳源包括葡萄糖和/或甘油，优选为甘油。本专利技术还提供了应用上述的制备方法制备得到的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。本专利技术还提供了生物材料，所述生物材料的活性成分包括上述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。本专利技术还提供了上述的制备方法或野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或生物材料在制备如下(A)-(C)中任一项的应用：(A)气肿疽梭菌疫苗；(B)气肿疽梭菌诊断抗原；(C)气肿疽梭菌单克隆抗体。此外，本专利技术还提供了一种气肿疽梭菌疫苗，所述气肿疽梭菌疫苗包括上述的野生型气肿疽梭菌细胞毒素A或生物材料；优选地，所述气肿疽梭菌疫苗包括野生型气肿疽梭菌细胞毒素A和辅料；优选地，所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的浓度为30～70μg/mL，优选为50μg/mL；优选地，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或MontanideISA系列佐剂；优选使用MontanideISA系列佐剂；更优选使用ISA35A佐剂。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的野生型气肿疽梭菌细胞毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，其特征在于，包括在革兰氏阳性菌表达系统中表达编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因，得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。/n

【技术特征摘要】
1.一种野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的制备方法，其特征在于，包括在革兰氏阳性菌表达系统中表达编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因，得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列；
优选地，所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将编码所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的基因导入pYL质粒中，提取阳性克隆质粒经RN4220转化后，将构建的质粒电击转化进入革兰氏阳性菌表达系统中，得到表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的重组微生物，通过对重组微生物的诱导表达得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，得到表达所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A的重组微生物后，还包括对所述重组微生物进行培养的步骤，然后通过对重组微生物的诱导表达得到所述野生型气肿疽梭菌细胞毒素A。


5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌表达系统包括如下(a)-(d)中的任一种:
(a)表皮葡萄球菌表达系统；
(b)枯草芽孢杆菌表达系统；
(c)谷氨酸棒状杆菌表达系统；
(d)乳酸杆菌表达系统。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌表达系统为表皮葡萄球菌表达系统；
优选地，所述重组微生物为重组表皮葡萄球菌株SE/pYL-CctA；
优选地，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺笋，王钢，任立松，潘晓梅，唐慧芬，张慧敏，王华荣，李新萍，赵兵，
申请(专利权)人：天康生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：新疆;65