用于抗肌萎缩蛋白病治疗的铰链1和/或4修饰的抗肌萎缩蛋白制造技术

公开了用于治疗抗肌萎缩蛋白病的组合物和方法。组合物包括修饰的抗肌萎缩蛋白多核苷酸，其编码具有修饰的铰链1(H1)和/或铰链4(H4)的经修饰的抗肌萎缩蛋白。还公开了通过施用编码具有修饰的铰链1(H1)和/或修饰的铰链4(H4)的经修饰的抗肌萎缩蛋白的组合物来治疗抗肌萎缩蛋白病的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于抗肌萎缩蛋白病治疗的铰链1和/或4修饰的抗肌萎缩蛋白相关申请的交叉引用本申请要求于2018年4月3日提交的美国临时申请序列号62/651,772的优先权，其全部内容通过引用并入本文。支持提交序列表的声明在此提供序列表的纸质副本和含有名称为“18UMC046_ST25.txt”的文件的序列表的计算机可读形式，并通过引用并入本文，该文件大小为151,883字节(以MICROSOFTEXPLORER测量)。序列表由SEQIDNO：1-18组成。关于联邦政府赞助的研究或开发的声明本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的NS090634的政府支持下完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。专利技术背景本公开涉及用于治疗抗肌萎缩蛋白病(dystrophinopathy)的组合物和方法。组合物包括经修饰的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)多核苷酸，其编码具有修饰的铰链1(H1)和/或铰链4(H4)的经修饰的抗肌萎缩蛋白。还公开了通过施用编码具有修饰的铰链1(H1)和/或修饰的铰链4(H4)的经修饰的抗肌萎缩蛋白的组合物来治疗抗肌萎缩蛋白病的方法。抗肌萎缩蛋白病是指由抗肌萎缩蛋白基因突变引起的一组疾病。抗肌萎缩蛋白病包括迪谢内肌营养不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)，贝克肌营养不良(Beckermusculardystrophy，BMD)，X连锁扩张型心肌病(X-linkeddilatedcardiomyopathy，XLDC)及其携带者(carrier)。>抗肌萎缩蛋白基因(2.4mb)是基因组中最大的基因之一。抗肌萎缩蛋白mRNA为14kb。抗肌萎缩蛋白由四个区域组成；氨基末端(NT)，具有24个血影蛋白(spectrin)样重复(R)区的中心棒结构域和四个铰链(H)区，富含半胱氨酸的结构域(CR)和羧基末端(CT)结构域。尽管已经广泛研究了NT，CR和CT的生物学功能以及在棒结构域和H2和H3中的重复序列，但对H1和H4的功能知之甚少。通过病毒或非病毒介导的基因递送将突变的抗肌萎缩蛋白基因替换为功能性抗肌萎缩蛋白基因是治疗抗肌萎缩蛋白病的高度有前途的策略。抗肌萎缩蛋白基因及其cDNA太大，无法包装到病毒载体，特别是腺伴随病毒(AVV)载体中。为此，开发合成的微(mini)基因和微型基因(microgene)引起了极大的兴趣。尤其重要的是AAV微量抗肌萎缩蛋白基因疗法(AAVmicro-dystrophingenetherapy)。使用AAV微基因载体已经启动了一些临床试验。可以改善当前抗肌萎缩蛋白微基因的策略对治疗抗肌萎缩蛋白病会是有益的。因此，存在替代的抗肌萎缩蛋白微基因和治疗抗肌萎缩蛋白病的方法的需求。专利技术简要说明一方面，本公开涉及编码经修饰的抗肌萎缩蛋白的核酸，其包括对铰链1(H1)区，铰链4(H4)区，及其组合中的至少一个的铰链区修饰。在一个方面，本公开涉及一种载体，其包含编码经修饰的抗肌萎缩蛋白的核酸，所述经修饰的抗肌萎缩蛋白包括对铰链1(H1)区，铰链4(H4)区，及其组合中的至少一个的铰链区修饰。在一个方面，本公开涉及一种在有需要的受试者中治疗抗肌萎缩蛋白病的方法。该方法包括将具有修饰的铰链区的经修饰的抗肌萎缩蛋白施用于有需要的受试者。附图简述当考虑到以下详细描述时，将更好地理解本公开，并且除上述那些之外的特征、方面和优点将变得显而易见。这样的详细描述参照以下附图，其中：图1是绘示pYL90(具有全长微抗肌萎缩蛋白的质粒)和pLW1(具有ΔH1微抗肌萎缩蛋白的质粒)的蛋白质结构的示意图。图2A和2B是Western印迹，其检测与BL6(对照)小鼠和未处理的mdx(“Mdx4cv未注射”)小鼠相比，经AAV病毒LW1处理的(图2A)和经AAV病毒YL90处理的(图2B)的mdx小鼠的表达。图3描绘了来自YL90，LW1，BL6和Mdx4cv小鼠的肌肉的图像，所述小鼠针对抗肌萎缩蛋白和抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合物的蛋白质进行了免疫染色。图4描绘了来自LW1处理的小鼠和YL90处理的小鼠的苏木精和曙红(H&E)染色的肌肉的图像，显示了相似的肌肉组织学。每个图像均来自独立的动物。图5A-5C是描绘肌力分析的图，在LW1处理的mdx4cv小鼠(“LW1inj”)，经YL90处理的mdx4cv小鼠(“YL90inj”，BL6(对照)小鼠和未处理的mdx4cv小鼠(“未注射”)中测量比抽搐力(specifictwitchforce)(图5A)，比力频率(specificforcefrequency)(图5B)和对拉伸诱导的损伤的抵抗力(力下降百分比)(图5C)。图6是绘示pYL90，pLW2，pLW3，pLW4，pLW5和pLW6微抗肌萎缩蛋白的蛋白质结构的示意图。图7A-7F是肌肉的图像，其中对来自YL90(图7A)，LW2(图7B)，LW3(图7C)，LW4(图7D)，LW5(图7E)和LW6(图7F)Mdx4cv小鼠的抗肌萎缩蛋白进行免疫染色。图8A-8F是Western印迹，其描绘了在Mdx4cv小鼠中YL90(图8A)，LW2(图8B)，LW3(图8C)，LW4(图8D)，LW5(图8E)和LW6(图8F)的表达。图9A-9F描绘了来自在Mdx4cv小鼠中YL90(图9A)，LW2(图9B)，LW3(图9C)，LW4(图9D)，LW5(图9E)和LW6(图9F)的H&E染色的肌肉的图像。图10是绘示与BL6(对照)小鼠和未处理的mdx(“Mdx4cv未注射”)小鼠相比，pYL90(具有全长微抗肌萎缩蛋白的质粒)和pLW3(具有H4中部分缺失的质粒)微抗肌萎缩蛋白的蛋白质结构的示意图。图11A和11B是Western印迹，其描绘了与在BL6小鼠中的抗肌萎缩蛋白相比，经LW3处理(图11A)和经YL90处理(图11B)的Mdx4cv小鼠的表达。图12A-12C是描绘了LW3(图12A)和黏着斑蛋白(Vinculin)(图12B)表达的Western印迹，以及定量LW3和YL90的表达水平的图(图12C)。图13是来自YL90，LW3，BL6和Mdx4cv小鼠的肌肉的图像，所述小鼠针对抗肌萎缩蛋白和抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合物的蛋白质进行了免疫染色。图14描绘了来自经LW3处理的小鼠和经YL90处理的小鼠的H&E染色的肌肉的图像，显示了相似的肌肉组织学。每个图像均来自独立的动物。图15A和15B是描绘肌力分析的图，在经LW3处理的mdx4cv小鼠(“LW3”)，经YL90处理的mdx4cv小鼠(“YL90”)，BL6(对照)小鼠和未处理的mdx4cv小鼠中测量比抽搐力(图15A)和对拉伸诱导的损伤的抵抗力(力下降百分比)(图15B)。尽管本公开内容可以进行各种修改和替代形式，但是其具体实施方式已经通过示例在附图中示出，并且在下文中进行详细描述。然而，应当理解，对特定实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.编码经修饰的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的核酸，所述抗肌萎缩蛋白包含以下铰链区修饰：对铰链1(H1)区的修饰，铰链4(H4)区的修饰，及其组合中的至少一个。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180403 US 62/651,7721.编码经修饰的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的核酸，所述抗肌萎缩蛋白包含以下铰链区修饰：对铰链1(H1)区的修饰，铰链4(H4)区的修饰，及其组合中的至少一个。


2.权利要求1的核酸，其中所述铰链1(H1)区的修饰选自铰链1(H1)区的完全缺失和铰链1(H1)区的部分缺失。


3.权利要求1的核酸，其中所述铰链4区的修饰是铰链4(H4)区的部分缺失。


4.载体，其包含编码经修饰的抗肌萎缩蛋白的核酸，所述经修饰的抗肌萎缩蛋白包含以下铰链区修饰：对铰链1(H1)区的修饰，铰链4(H4)区的修饰，及其组合中的至少一个。


5.权利要求4的载体，其中所述H1区的修饰选自铰链1(H1)区的完全缺失和铰链1(H1)区的部分缺失。


6.权利要求4的载体，其中所述铰链4(H4)区的修饰是铰链4(H4)区的部分缺失。


7.权利要求4的载体，其中所述载体选自病毒载体和非病毒载体。


8.权利要求7的载体，其中所述病毒载体选自慢病毒载体和腺伴随病毒载体。


9.权利要求8的载体，其中所述腺伴随病毒载体选自以下：腺伴随病毒血清型1(AVV-1)，腺伴随病毒血清型5(AVV-5)，腺伴随病毒血清型6(AVV-6)，腺伴随病毒血清型8(AVV-8)，腺伴随病毒血清型9(AVV-9)，腺伴随病毒血清型rh74(AVV-rh74)，腺伴随病毒2i8(AVV-2i8)，腺伴随病毒B1(AVV-B1)，腺伴随病毒CAM130(AVV-CAM130)，腺伴随病毒M41(AVV-M41)，腺伴随病毒MTP(AAV587MTP和AAV588MTP)，腺伴随病毒NP22(AAV-NP22)，腺伴随病毒NP66(AAV-NP66)，腺伴随病毒MYO(AAVMYO)，腺伴随病毒酪氨酸突变体和祖先腺伴随病毒(ancAVV)。


10.权利要求4的载体，其还包含组织特异性启动子。


11.权利要求10的载体，其中所述组织特异性启动子选自肌肉特异性启动子和心脏特异性启动子。


12.用于在有此需要的受试者中治疗抗肌萎缩蛋白病的...

【专利技术属性】
技术研发人员：D段，L瓦萨拉，Y赖，Y岳，
申请(专利权)人：密苏里大学管理机构，
类型：发明
国别省市：美国;US