本发明专利技术提供一种用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒。所述试剂盒中包含扩增目的基因VP2的引物对(SEQ ID NO:1‑2)以及检测目的基因的Taqman探针(SEQ ID NO:3)。本发明专利技术还提供猫泛白细胞减少症病毒的实时荧光定量PCR检测方法，该方法能够快速、灵敏地检测出猫泛白细胞减少症病毒，提高了检测结果的准确性，对于临床样品的快速诊断具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒
本专利技术涉及核酸检测技术，具体地说，涉及一种用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒。
技术介绍
猫泛白细胞减少症病毒(felinepanleukopeniavirus，FPV)是细小病毒科，细小病毒亚科成员，通常引起幼猫急性且致命的疾病，引起严重的胃肠炎和免疫抑制性疾病，具有高度的传染性，其中幼小易感动物发病率和死亡率高达25～90％，成年猫感染后常常出现免疫应答，无典型临床症状，怀孕母猫感染后，经过血液循环可以扩散至胚胎，造成感染并且导致流产。犬细小病毒(canineparvovirus，CPV)由FPV进化而来，虽然CPV与FPV基因组序列仅有0.5％的差异，但CPV-2不能在猫体内复制，但其变体(CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)能够感染且在猫体内复制，给FPV的诊断带来挑战。目前，对FPV检测方法主要包括电镜观察法，观察是否符合FPV形态特征、病毒分离培养法、血清学监测法、血凝(HA)和血凝抑制实验(HI)，常见的FPV核酸检测方法包括普通PCR和GreenI实时荧光定量PCR，该方法基于Green染料与DNA双螺旋小沟结合的原理，实现荧光定量。但这种结合为非特异性的，非特异性产物和引物二聚体的形成，无法达到检测目的。且上述方法存在检测周期较长且敏感性低的问题，不适合临床样品的快速检测和流行病学调查。目前尚无TaqManqPCR技术检测猫泛白细胞减少症病毒的相关报道，VP2为主要结构蛋白，是猫泛白细胞减少症病毒衣壳的主要成分，暴露于衣壳蛋白表面，是病毒的主要免疫保护性抗原蛋白，本专利技术针对病毒VP2基因建立快速、敏感的TaqManqPCR检测试剂盒，用于临床早期诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测猫泛白细胞减少症病毒的引物和探针及检测试剂盒。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一对猫泛白细胞减少症病毒检测引物，包括序列如SEQIDNO:1所示的正向引物和序列如SEQIDNO:2所示的反向引物。第二方面，本专利技术提供与所述引物配套使用的探针，探针序列如SEQIDNO:3所示，探针序列的5′端具有荧光基团，3′端具有淬灭基团。第三方面，本专利技术提供含有SEQIDNO:1-2所示引物和/或SEQIDNO:3所示探针的检测试剂或试剂盒。第四方面，本专利技术提供猫泛白细胞减少症病毒检测试剂盒，包括SEQIDNO:1-3所示的引物和探针。所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶、可溶性镁盐、PCR反应缓冲液、阳性标准质粒等中的至少一种。第五方面，本专利技术提供一种用于检测猫泛白细胞减少症病毒的qPCR反应体系，所述反应体系按20μL计包含：2×AceQqPCRProbeMasterMix10μl，DNA模板1μl，10μM正向引物和反向引物各0.2～1μl，10μM探针0.4～0.6μl，ddH2O补齐至20μl。第六方面，本专利技术提供猫泛白细胞减少症病毒检测方法(含非诊断目的)，包括如下步骤：(1)提取待测样品中的DNA；(2)以DNA为模板，利用SEQIDNO:1-3所示的引物和探针进行PCR扩增；(3)分析PCR扩增产物。优选地，步骤(2)的PCR反应体系为：2×AceQqPCRProbeMasterMix10μl，DNA模板1μl，10μM正向引物和反向引物各1μl，10μM探针0.4μl，ddH2O补齐至总体积20μl。步骤(2)的PCR扩增条件为：93～95℃预变性3～5min；93～95℃变性10～15s，55～65℃退火及延伸30～45s。PCR扩增条件优选为：95℃预变性5min；95℃变性15s，59℃退火及延伸30s，40个循环。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术提供的检测猫泛白细胞减少症病毒的TaqMan实时荧光定量PCR(TaqManqPCR)检测方法，提高了检测结果的准确性。特异性实验结果显示，本方法可以特异性地扩增出猫泛白细胞减少症病毒的qPCR曲线，具有检测FPV和CPV及其变体的能力，而对感染猫的其他常见病毒均无扩增曲线。重复性实验结果表明，组内和组间Ct值变异系数较低(<1％)并且差异较小，表明该方法重复性较稳定，实验结果可靠。标准曲线显示，该方法具有良好的相关性(R2＝0.9997)和优异的扩增效率(扩增效率在90％～110％之间)。敏感性实验结果显示，qPCR的敏感度是普通PCR的10倍，最低可检测到的质粒浓度为115copies/μL。本专利技术为临床样品的快速诊断提供有效手段。附图说明图1为本专利技术较佳实施例中猫泛白细胞减少症病毒VP2基因扩增结果；其中，M：DNA分子质量标准；1-4：FPVVP2基因；5：阴性对照。图2为本专利技术较佳实施例中FPVTaqManqPCR特异性试验和检测CPV-2变体的能力；其中，A：FPV；B：CPV-2c；C：CPV-2b；D：CPV-2a；E：FHV-1；F：FCV；G：阴性对照。图3为本专利技术较佳实施例中FPVTaqManqPCR敏感性检测实验；其中，1～6：1.15×102～1.15×107copies/μL质粒。图4为本专利技术较佳实施例中FPVTaqManqPCR标准曲线。图5为本专利技术较佳实施例中FPV普通PCR敏感性检测实验；其中，M：DNA分子质量标准；1～6：1.15×102～1.15×107copies/μL质粒。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本专利技术中涉及的AceQqPCRProbeMasterMix来自于南京诺唯赞生物科技有限公司生产的荧光探针PCR试剂盒。实施例1基于TaqManqPCR技术建立猫泛白细胞减少症病毒检测方法1、标准品制备方法根据GenBank公布的猫泛白细胞减少症病毒VP2基因，利用MEGA5.0软件通过多重比对获得病毒高度保守区域，利用DNAMAN软件，设计一对引物，用于标准品的构建，同时设计一对特异性引物及TaqMan探针，用于病毒TaqManqPCR扩增。用于TaqManqPCR扩增的引物序列(SEQIDNO:1-3)：FPV-qPCR-F：5′-TTAATACCATCTCATACTGGAACT-3′(VP2基因位置：652bp～675bp)FPV-qPCR-R：5′-TTGAACATCATCTGGATCTG-3′(VP2基因位置：707bp～726bp)TaqManprobe：5′-FAM-TGGCACACCAACAATGTATATCATG-BHQ1-3′(VP2基因位置：678b本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.猫泛白细胞减少症病毒检测引物，其特征在于，包括序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。/n
【技术特征摘要】
1.猫泛白细胞减少症病毒检测引物，其特征在于，包括序列如SEQIDNO:1所示的正向引物和序列如SEQIDNO:2所示的反向引物。
2.与权利要求1所述引物配套使用的探针，其特征在于，探针序列如SEQIDNO:3所示，探针序列的5′端具有荧光基团，3′端具有淬灭基团。
3.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的检测试剂或试剂盒。
4.猫泛白细胞减少症病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物和权利要求2所述探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶、可溶性镁盐、PCR反应缓冲液、阳性标准质粒中的至少一种。
6.用于检测猫泛白细胞减少症病毒的qPCR反应体系，其特征在于，所述反应体系按20μL计包含：2×AceQqPCRProbeMasterMix10μl，DNA模板1μl，10μM正向引物和反向引...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁瑞英，梁琳，崔尚金，翟志安，赵静杰，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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