CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠、建立方法技术

本发明专利技术属于基因敲除技术领域，公开了一种CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠、建立方法，通过载体设计和构建，及gRNA和Cas9蛋白的制备；设计gRNA序列和打靶载体；利用In‑Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；显微注射及F0鼠鉴定；将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠；F1代鼠的繁殖和鉴定；将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，成果获得了多囊肾基因PKD1基因敲除小鼠。

【技术实现步骤摘要】
CRISPRCas9条件性基因敲除鼠、建立方法
本专利技术属于基因敲除
，尤其涉及一种CRISPRCas9条件性基因敲除鼠、建立方法。
技术介绍
基因敲除(knockout)是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。基因敲除和基因嵌入技术是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/LoxP系统、FLPI系统等。基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠，它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段，具有广泛的应用前景和商业价值。基因敲除技术主要应用于动物模型的建立，而最成熟的实验动物是小鼠，对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。然而，现有基因敲除效果差。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有基因敲除效果差。解决以上问题及缺陷的意义为：CRISPRCas9系统是近年来兴起的一种新型基因编辑技术。它是一种原核生物免疫系统，被用来抵抗噬菌体病毒和外源质粒等外来遗传物质的入侵。它能够识别并切断外源DNA，正是由于如此精确的靶向功能，使得外源基因的表达被沉默。CRISPRCas9基因编辑技术，构建基因敲除小鼠模型的试验研究有很多，其作为一种新型的基因编辑工具，相较于传统基因编辑技术具有操作便捷、低成本、高效率等优点。CRISPR/Cas9系统具有设计灵活、成本低、操作简单、准确性高、可多位点同时打靶等优势。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种CRISPRCas9条件性基因敲除鼠、建立方法。本专利技术是这样实现的，一种CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法，所述CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法通过载体设计和构建，及gRNA和Cas9蛋白的制备；设计gRNA序列和打靶载体；利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；显微注射及F0鼠鉴定；将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠；F1代鼠的繁殖和鉴定；将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代。进一步，所述CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白。进一步，所述CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠。进一步，所述CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，至少3只经PCR和Southern验证的F1代鼠；冻存：3年。本专利技术的另一目的在于提供一种所述CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法在大型哺乳动物的基因敲除模型构建中的应用。结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：CRISPRCas9系统是近年来兴起的一种新型基因编辑技术。它是一种原核生物免疫系统，被用来抵抗噬菌体病毒和外源质粒等外来遗传物质的入侵。它能够识别并切断外源DNA，正是由于如此精确的靶向功能，使得外源基因的表达被沉默。迄今为止，Cas9广泛用于在各种物种和细胞类型(包括人类细胞系、细菌、斑马鱼、酵母、小鼠、果蝇、圆虫、大鼠、普通作物、猪和猴子)中实现有效的基因组编辑。本专利技术通过载体设计和构建，及gRNA和Cas9蛋白的制备；设计gRNA序列和打靶载体；利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；显微注射及F0鼠鉴定；将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠；F1代鼠的繁殖和鉴定；将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代，大大提高基因敲除效果。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供的CRISPRCas9条件性基因敲除鼠的建立方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的繁育方案示意图。图3是本专利技术实施例提供的鉴定方案示意图。图4是本专利技术实施例提供的PCR引物1鉴定为阳性的小鼠(突变型:3.4kb)示意图。图5是本专利技术实施例提供的PCR引物2鉴定为阳性的小鼠(突变型:4.0kb)示意图。图6是本专利技术实施例提供的测序结果示意图。图7是本专利技术实施例提供的SouthernBlot验证示意图。图8是本专利技术实施例提供的4只小鼠均为阳性示意图。图9是本专利技术实施提供的定位策略概述图。图10是本专利技术实施提供的点图概述图。图11是本专利技术实施提供的GC内容分发概述图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种CRISPRCas9条件性基因敲除鼠、建立方法，下面结合附图对本专利技术作详细的描述。如图1所示，本专利技术提供的CRISPRCas9条件性基因敲除鼠的建立方法包括以下步骤：S101：利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法，其特征在于，所述CRISPR Cas9条件性基因敲除鼠建立方法通过载体设计和构建，及gRNA和Cas9蛋白的制备；设计gRNA序列和打靶载体；利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；显微注射及F0鼠鉴定；将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠；F1代鼠的繁殖和鉴定；将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代。/n

【技术特征摘要】
1.一种CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法，其特征在于，所述CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法通过载体设计和构建，及gRNA和Cas9蛋白的制备；设计gRNA序列和打靶载体；利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序对打靶载体进行验证；同时制备gRNA和Cas9蛋白；显微注射及F0鼠鉴定；将得到的Donor载体、gRNA和Cas9蛋白共注射到受精卵；将显微注射后的受精卵送回到代孕鼠输卵管中；鼠出生后进行PCR和测序鉴定，获得阳性F0鼠；F1代鼠的繁殖和鉴定；将性成熟的阳性F0鼠分别与野生型鼠配繁一代。


2.如权利要求1所述的CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法，其特征在于，所述CRISPRCas9条件性基因敲除鼠建立方法利用In-Fusion技术构建打靶载体，通过酶切、PCR及测序...

【专利技术属性】
技术研发人员：马广强，牛玲，韩飞，艾志福，黄小英，杨明，
申请(专利权)人：江西中医药大学，
类型：发明
国别省市：江西;36