一种经修饰荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种寡核苷酸探针，其包含寡核苷酸分子和与所述寡核苷酸分子结合的标记物，其中，所述寡核苷酸分子包含：能形成发夹结构的自互补区、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区，所述标记物（a）当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号，或（b）当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。

【技术实现步骤摘要】
一种经修饰荧光探针及其应用
本专利技术涉及核酸分子检测领域，具体涉及荧光探针领域，更具体包括经修饰荧光探针、其制备方法和应用。
技术介绍
荧光探针技术是基于荧光共振能量转移基础，用于核酸定性、定量的检测技术。含有某种特异序列的核苷酸序列上包含一对荧光物质，其中一个是能量的供体，另一个为能量的受体。当供体和受体在空间上足够近时，激发供体产生的荧光能量被受体吸收，检测器只获得一个本底背景荧关信号。在荧光PCR检测过程中，通过把目的核酸序列含量与供体、受体空间距离变化带来的荧光信号改变进行正向关联的方式，进行目的核酸的定性、定量检测。目前常用的荧光探针技术，主要包括水解探针法（包括Taqman技术和MGB技术）和杂交探针法（包括双杂交探针和分子信标技术）。Taqman水解探针在检测靶位点完全匹配的序列基础上，5’端加上荧光报告基团，3’端加上淬灭基团，常见的荧光基团包括FAM、VIC、HEX、CY5等，常见的淬灭基团有TAMRA、BHQ等。在未进行PCR检测时，荧光基团和淬灭基团空间位置很近，荧光基团因淬灭而不产生荧光。PCR检测退火过程中探针结合到目标序列上，扩增Taq酶延伸到探针结合位置时，其5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，荧光基团释放，产生荧光信号。随着目标序列的增加，被Taq酶降解的探针越多，产生的荧光信号也就越多。从而可以进行扩增曲线绘制和定量。分子信标技术是另一种常见荧光探针设计方式，其两端的核酸序列互补配对，形成茎环结构，茎部分的序列与检测靶位点序列无关但具备互补性，使两端标记的荧光基团和淬灭基团空间位置紧紧靠近，具有本底信号低的特征。探针的环状位置是目标位点识别序列。分子信标探针不依赖于扩增过程中Taq酶的降解，而是在检测过程中打开茎环结构，当环状位置序列与目标序列结合时，保持整个探针是打开状态，使得荧光基团和淬灭基团空间位置分开，从而产生可检测的荧光。DNA甲基化是重要的表观遗传修饰，已有研究发现DNA甲基化参与到众多生命过程的调节，特别是与肿瘤的发生、发展相关。目前已有众多DNA甲基化检测技术，这其中基于亚硫酸氢盐转化后的荧光PCR检测，依然是对已知靶点检测最实用的一项技术。经亚硫酸氢盐处理后的DNA序列，其碱基平衡性差，DNA损伤断裂多，因而PCR检测的难度相对常规检测大，检测特异性和准确性低。因此需要背景信号弱、灵敏度高同时具备特异性高的一种荧光PCR检测方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是在于提供一种特异性强、背景信号弱的荧光探针。具体而言，本专利技术第一方面提供一种寡核苷酸分子，包含：能形成发夹结构的自互补区、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区。在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸分子用于与靶核酸杂交。在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸分子还包含位于靶核酸识别区和靶核酸识别类似区之间的接头区。在一个或多个实施方案中，自互补区包括5’末端互补区、3’末端互补区，在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸分子从5’至3’依次包含：5’末端互补区、靶核酸识别区、接头区、靶核酸识别类似区、与5’末端互补区互补的3’末端互补区。在一个或多个实施方案中，自互补区（5’末端互补区或3’末端互补区）包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个核苷酸，或1-20个核苷酸，更优选1-10个核苷酸。在一个或多个实施方案中，5’末端互补区或3’末端互补区的GC含量大于55%、60%、70%、80%或90%。在一个或多个实施方案中，所述靶核酸识别区包含与靶核酸中序列相同或互补的核苷酸序列。在一个或多个实施方案中，靶核酸识别区具有至少3个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个核苷酸，或5-50个核苷酸，更优选10-30个核苷酸。在一个或多个实施方案中，所述靶核酸中序列是经转化的核苷酸序列。优选地，所述转化是非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。在一个或多个实施方案中，所述靶核酸识别类似区包含与所述靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体相同或互补的核苷酸序列。在一个或多个实施方案中，所述靶核酸中序列片段的序列中至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%是C。在一个或多个实施方案中，所述靶核酸中序列片段起始于所述靶核酸中序列的5’端的至少第1个、至少第2个、至少第3个、至少第4个、至少第5个、至少第6个、至少第7个、至少第8个、至少第9个、至少第10个、至少第11个、至少第12个核苷酸。在一个或多个实施方案中，所述靶核酸中序列片段的长度是靶核酸中序列的长度的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。在一个或多个实施方案中，所述修饰包括双脱氧化、磷酸化、生物素化、巯基取代、甲基化、氨基化、硫代、氟代、溴代、次黄嘌呤取代、碱基的置换（转换）或颠换。优选地，所述修饰是碱基的置换。更优选地，所述修饰选自以下一种或多种（1）G变为A，（2）A变为G，（3）T或U变为C，（4）C变为T或U。优选地，所述修饰是靶核酸中序列或其片段的C置换为T或U。在一个或多个实施方案中，所述靶核酸中序列或其片段中的C是甲基化的C，例如是CpG中的C。在一个或多个实施方案中，所述靶核酸识别类似区的长度是靶核酸识别区的长度的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。在一个或多个实施方案中，所述靶核酸识别类似区的长度是靶核酸识别区的长度的10-99%、15-90%、20-80%、30-70%、30-60%、30-50%、30-40%、30-35%。在一个或多个实施方案中，所述靶核酸识别类似区包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个核苷酸，或1-30个核苷酸，更优选2-20个核苷酸。在一个或多个实施方案中，接头区包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个核苷酸，或1-20个核苷酸，更优选1-10个核苷酸。在一个或多个实施方案中，所述接头区不与靶核酸杂交。在一个或多个实施方案中，所述接头区不与靶核酸识别区或其互补序列杂交。在一个或多个实施方案中，所述接头区不是回文序列。在一个或多个实施方案中，靶核酸是DNA或RNA。本专利技术还提供一种寡核苷酸探针，其包含本文第一方面所述的寡核苷酸分子和与所述寡核苷酸分子结合的标记物，所述标记物（a）当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号，或（b）当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。在一个或多个实施方案中，所述可检测信号是荧光信号，所述标记物包括位于所述寡核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种寡核苷酸分子，包含：能形成发夹结构的自互补区、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区，和任选的位于靶核酸识别区和靶核酸识别类似区之间的接头区，所述靶核酸识别区包含与靶核酸中序列相同或互补的核苷酸序列，所述靶核酸识别类似区包含与所述靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体相同或互补的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种寡核苷酸分子，包含：能形成发夹结构的自互补区、靶核酸识别区和靶核酸识别类似区，和任选的位于靶核酸识别区和靶核酸识别类似区之间的接头区，所述靶核酸识别区包含与靶核酸中序列相同或互补的核苷酸序列，所述靶核酸识别类似区包含与所述靶核酸中序列或其片段的经修饰的变体相同或互补的核苷酸序列。


2.如权利要求1所述的寡核苷酸分子，其特征在于，所述自互补区包括5’末端互补区、3’末端互补区。


3.如权利要求2所述的寡核苷酸分子，其特征在于，所述寡核苷酸分子从5’至3’依次包含：5’末端互补区、靶核酸识别区、接头区、靶核酸识别类似区、与5’末端互补区互补的3’末端互补区。


4.如权利要求1或2所述的寡核苷酸分子，其特征在于，
所述自互补区包含至少1个核苷酸，和/或
所述接头区包含至少1个核苷酸，和/或
所述靶核酸识别区具有至少3个核苷酸，和/或
所述靶核酸中序列的片段的序列中至少10%是C，和/或
所述靶核酸中序列的片段起始于所述靶核酸中序列的5’端的至少第1个核苷酸，和/或
所述靶核酸中序列的片段的长度是靶核酸中序列的长度的至少10%。


5.如权利要求1或2所述的寡核苷酸分子，其特征在于，所述修饰包括双脱氧化、磷酸化、生物素化、巯基取代、甲基化、氨基化、硫代、氟代、溴代、次黄嘌呤取代、碱基的置换或颠换。


6.如权利要求5所述的寡核苷酸分子，其特征在于，所述修饰是碱基的置换。


7.如权利要求6所述的寡核苷酸分子，其特征在于，所述碱基的置换是C置换为T或U。


8.一种寡核苷酸探针，包含权利要求1-7中任一项所述的寡核苷酸分子和与所述寡核苷酸分子结合的标记物，所述标记物：（a）当探针为非杂交形式时提供可检测信号、但当探针与互补核酸杂交时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号，或（b）当探针与互补核酸杂交时提供可检测信号、但当探针为非杂交形式时可检测信号减弱或基本不提供可检测信号。


9.如权利要求8所述的寡核苷酸探针，其特征在于，所述可检测信号是荧光信号，所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和激发基团，或所述标记物包括位于所述寡核苷酸分子两端的荧光报告基团和淬灭基团。


10.包含权利要求1-7中任一项所述的寡核苷酸分子或权利要求8或9所述的寡核苷酸探针的试剂盒，所述试剂盒还任选包含检测靶核酸或检测核酸扩增的其他试剂。


11.一种检测靶核酸的方法，包括：
（1）将权利要求8或9所述的寡核苷酸探针与靶核酸接触，
（2）测定接触后混合物的可检测信号，和
（3）基于所述可检测信号检测靶核酸的存在和/或水平。


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【专利技术属性】
技术研发人员：王辉，刘蕊，何东华，
申请(专利权)人：上海鹍远健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31