一种有效提取植物线粒体的方法技术

一种有效提取植物线粒体的方法，该方法的技术核心在于差速离心结合无机氧化铝滤膜，主要针对植物叶肉细胞，高效分离纯化线粒体，其步骤为：1)植物材料的培养；2)研磨缓冲液的配制；3)样品的制备；4)针头注射器滤膜过滤；5)荧光显微镜检测线粒体。本发明专利技术操作便捷、效果稳定，对探究植物线粒体功能具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种有效提取植物线粒体的方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种有效提取植物线粒体的方法。
技术介绍
线粒体是细胞生命活动的“动力加工厂”，具有半自主遗传的特性。细胞生命活动很多至关重要的过程都与线粒体相关，例如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。植物细胞中由于叶绿体的干扰，给线粒体的提纯造成了很大的阻碍，尤其是叶肉细胞。以往的研究中，为了避免叶绿体等质体的干扰，多选取黄化苗或根或悬浮细胞，无叶绿体的组织为实验材料，利用线粒体和叶绿体密度不同的机理，采用蔗糖或percoll梯度密度离心的方式进一步分离纯化线粒体。然而，线粒体和叶绿体除了密度不同外，其大小也有所不同。细胞中的线粒体大小为0.5-10μm，植物叶肉细胞中线粒体大小为1-3μm，叶绿体大小为5-10μm。现有技术中多采用差速离心与密度梯度离心结合的方法分离植物组织的线粒体，该方法步骤繁琐，分离纯化过程线粒体易出现粘连、叶绿体碎片干扰的状况，阻碍了植物线粒体的功能研究。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种有效提取植物线粒体的方法，基于低温差速离心和针头注射器滤膜技术，利用氧化铝针头注射器膜高效分离提纯植物叶肉细胞中线粒体，借助高速离心机，结合滤膜的特点，可以快速、高效、便捷地提取纯化线粒体。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种有效提取植物线粒体的方法，差速离心结合无机氧化铝滤膜，针对植物叶肉细胞，分离纯化线粒体，具体步骤为：1)取植物材料，研磨过滤，所得溶液低温差速离心，获得粗线粒体；2)利用氧化铝针头注射器滤膜，过滤粗线粒体的重悬溶液，获得纯净的线粒体。所述步骤1)中，取单标转基因AtDIPS-GFP拟南芥或烟草，培养在穴盘中，经光照，暗培养，持续培养，得到供使用的植物材料，将其叶片剪成0.5×0.5cm2，浸泡在研磨缓冲液(BufferA)中，研磨样品，并经纱布过滤和尼龙布过滤；所述步骤2)中，加入30mL研磨缓冲液，用毛笔重悬线粒体粗沉淀，沉淀用毛笔轻轻悬浮，再次低温离心，加入重悬缓冲液(BufferB)重悬，经两次氧化铝针头注射器滤膜过滤，轻轻手推，避免用力过猛。所述穴盘中，以质量计，营养土：压缩土：蛭石＝1：1：1，温度为23+1℃，所述光照的时间为16-20h，暗培养的时间为8-10h，拟南芥持续培养时间为4周，烟草持续培养时间为8周；所述研磨时间小于10分钟，所述纱布过滤使用4层纱布过滤，尼龙布过滤使用两层200目尼龙布过滤。所述研磨缓冲液的成分为：0.3M蔗糖、5mMEDTA、50mMTris-HCl，并在使用前加入质量体积比1％的bovineserumalbumin、15mM的β-mercaptoethanol以及质量体积比5％的pvp-40，所有成分混合后0.22μm滤膜过滤，4℃放置待用；所述重悬缓冲液的成分为：350mMsorbitol、5mMEDTA、50mMTris-HCl，混合后0.22μm滤膜过滤，4℃放置待用。所述再次低温离心的参数为14500g，15min，4℃。所述低温差速离心中，低温控制在4℃，差速分为500g、10min；1000g、10min；3500g、15min；3500g、10min；14500g、15min五个步骤。所述两次氧化铝针头注射器滤膜过滤中，第一次选用的滤膜孔径为5μm，第二次滤膜孔径为3μm。所述氧化铝针头注射器滤膜为非晶氧化铝膜，能够为细胞的附着和生长提供刚性、均匀的表面，并且在潮湿时折射指数为1.60+/-0.01，使得光学显微镜能够清晰观察到细胞的成长；其材质为无机氧化铝，其颗粒保留能力使得颗粒在膜表面被筛分，而不是在膜孔内某处。所述氧化铝针头注射器滤膜具有均匀分布的纳米孔结构，且厚度、孔径、孔间距、孔隙率均高度可控。在获得纯净的线粒体后，利用荧光显微检测观察所得到的线粒体：GFP观察线粒体，RFP观察叶绿体。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、利用氧化铝针头注射器滤膜过滤的方法分离纯化差速离心获得的粗线粒体沉淀，进而可得到较为纯净的线粒体，为线粒体研究领域提供了一种改进的简单、便捷线粒体获取方法，可为植物线粒体研究提供技术支持。2、本专利技术氧化铝针头注射器膜为无机膜，由一种特殊形式的非晶氧化铝膜构成，具有均匀分布的纳米孔结构，其厚度、孔径、孔间距、孔隙率等均高度可控，10-200nm之间，具有超高效的颗粒保留能力，颗粒在膜表面被筛分，而不是在膜孔内某处，为细胞的附着和生长提供刚性、均匀的表面，并且由于潮湿时几乎透明，使得光学显微镜较易观察到细胞的成长。(潮湿时折射指数为1.60+/-0.01)。3、由于不需要复杂的梯度密度离心，因此具有简单、便捷的优点。4、本专利技术可以实现植物线粒体的有效富集，所得线粒体均匀分散在溶液中，不存在粘连的现象，有效排除叶绿体的干扰，可为植物线粒体的提取和纯化提供新思路。附图说明图1是基于差速离心，利用氧化铝针头注射器滤膜高效分离提纯植物叶肉细胞中线粒体的流程图。图2是基于本专利技术利用荧光显微镜观察的线粒体提取的结果，其中图2a为粗线粒体沉淀悬浮溶液，图2b为过滤膜后的结果。具体实施方式下面结合附图和实施例详细说明本专利技术的实施方式。如图1所示，本专利技术一种有效提取植物线粒体的方法，差速离心结合无机氧化铝滤膜，针对植物叶肉细胞，分离纯化线粒体，其主要步骤为：1)植物材料的培养：将AtDIPS-GFP单标转基因的烟草或拟南芥培养在穴盘中，以质量计，营养土：压缩土：蛭石＝1：1：1，温度23+1℃，16-20h光照，8-10h暗培养，烟草培养8周，拟南芥4周，注意及时补充水分。材料的生长状态是植物线粒体提取成败的重要因素。2)研磨缓冲液的配制：①研磨缓冲液(BufferA)：300mM蔗糖(维持细胞内外的渗透压)、5mMEDTA、50mMTris-HC1、(1％(w/v)bovineserumalbumin，15mMβ-mercaptoethanol，5％(w/v)pvp-40，使用前加，具有抗氧化，保护巯基，抑制多酚氧化酶的作用)，所有成分混合后0.22μm滤膜过滤，4℃放置；②重悬缓冲液(BufferB)：350mMsorbitol(维持细胞内外的渗透压)、5mMEDTA、50mMTris-HCl，可调整pH＝8.0左右，混合后0.22μm滤膜过滤，4℃放置。3)制备样品：所有操作未标注都在4℃进行。将培养的植物材料的叶片剪成0.5×0.5cm2，浸泡在BufferA中，研磨样品(＜10min)，4层纱布过滤，2层200目尼龙布过滤，将所得溶液分装在50mL离心管中，500g、10min；1000g、10min；3500g、15min；3500g、10min；14500g、15min；进行低温差速离心，得到粗线粒体。之后在粗线粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种有效提取植物线粒体的方法，差速离心结合无机氧化铝滤膜，针对植物叶肉细胞，分离纯化线粒体，其特征在于，步骤为：/n1)取植物材料，研磨过滤，所得溶液低温差速离心，获得粗线粒体；/n2)利用氧化铝针头注射器滤膜，过滤粗线粒体的重悬溶液，获得纯净的线粒体。/n

【技术特征摘要】
1.一种有效提取植物线粒体的方法，差速离心结合无机氧化铝滤膜，针对植物叶肉细胞，分离纯化线粒体，其特征在于，步骤为：
1)取植物材料，研磨过滤，所得溶液低温差速离心，获得粗线粒体；
2)利用氧化铝针头注射器滤膜，过滤粗线粒体的重悬溶液，获得纯净的线粒体。


2.根据权利要求1所述有效提取植物线粒体的方法，其特征在于，所述步骤1)中，取单标转基因AtDIPS-GFP拟南芥或烟草，培养在穴盘中，经光照，暗培养，持续培养，得到供使用的植物材料，将其叶片剪成0.5×0.5cm2，浸泡在研磨缓冲液中，研磨样品，并经纱布过滤和尼龙布过滤；所述步骤2)中，加入30mL研磨缓冲液，用毛笔重悬线粒体粗沉淀，沉淀用毛笔轻轻悬浮，再次低温离心，加入重悬缓冲液重悬，经两次氧化铝针头注射器滤膜过滤，轻轻手推，避免用力过猛。


3.根据权利要求2所述有效提取植物线粒体的方法，其特征在于，所述穴盘中，以质量计，营养土：压缩土：蛭石＝1：1：1，温度为23+1℃，所述光照的时间为16-20h，暗培养的时间为8-10h，拟南芥持续培养时间为4周，烟草持续培养时间为8周；所述研磨时间小于10分钟，所述纱布过滤使用4层纱布过滤，尼龙布过滤使用两层200目尼龙布过滤。


4.根据权利要求2所述有效提取植物线粒体的方法，其特征在于，所述研磨缓冲液的成分为：0.3M蔗糖、5mMEDTA、50mMTris-HCl，并在使用前加入质量体积比1％的bovineserumalbumin、15mM的β-mercaptoethanol以及质量体积比5％的pvp-40，所有成分混合后0.22...

【专利技术属性】
技术研发人员：于婷乔，段光兴，袁英，张立光，张泉，苏都莫日根，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11