一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法技术

本发明专利技术适用于生物技术领域，提供了一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法，是通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒，利用EDC/NHS活化剂将抗体、拉曼报告分子偶联到银纳米颗粒以及磁性纳米颗粒表面，制备得到两种靶向目标抗原的拉曼探针；再利用拉曼探针检测特定抗原。本发明专利技术检测方法基于一对免疫夹心法的拉曼探针，这两个探针上具有结合目标抗原的抗体。两个探针能与目标抗原结合形成免疫复合物，进而激发表面增强拉曼效应，从而实现检测目标抗原。本发明专利技术改进了抗体在纳米颗粒表面的固相连接方式，进而提高探针的检测效率。这项检测方法具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种均相检测方法，尤其涉及一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法。
技术介绍
蛋白、多肽、基因等生物分子检测技术是临床检测中最为关键的技术，快速、简单的检测手段是提高医院检测效率的基础，准确、灵敏的检测结果则是提高医师诊断结果的必要条件。在临床诊断中，医师往往对病人血清等体液中可以用于疾病诊断的分子进行检测分析，如肿瘤标志物、激素等。血清中与疾病密切相关的生物分子密切反映着疾病的发生、生成和改变，因此得到了众多科研工作者和临床一线检测人员的关注。总而言之，检测血清中生物分子的方法主要分为酶联免疫吸附剂测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)、荧光分析法和光电化学免疫分析法等。1、酶联免疫吸附剂测定酶联免疫吸附剂测定诞生于20世纪70年代，它建立在免疫分析原理反应基础上，由酶进行标记替代传统具有危害性的放射性核素标记。值得注意的是，酶标分子体积虽然大但并没有降低降低抗体抗原间的识别能力。2、荧光免疫分析法荧光分析法基于荧光化合物设计荧光探针对靶标进行检测，使用安全且相对便宜，通过简单的仪器便能对荧光进行快速的捕获分析。可用做荧光标记的物质多种多样，比如荧光性质优良的稀土金属(Eu和Tb)。3、光电化学免疫分析法光电化学分析(photoelectrochemistry，PEC)是基于光电材料的光电转换能力而进行痕量检测的新型检测方法，进行免疫测定时，人们多利用抗体抗原或核酸适配体之间的特异性结合。在光照条件下光电材料将免疫反应情况转变为电信号，进而定量样品。检测血清中生物分子的方法虽种类繁多，从传统的化学发光酶免疫分析到交叉融合的光电化学免疫分析法不胜枚举，但其中也不乏缺点。比如传统ELISA等常规夹心型免疫测定方法中需要多次洗涤多次孵育，耗时耗力，且检测限不足。以核酸适配体作为替代品代替抗原抗体间的特异性识别时，虽然核酸适配体体积小，方便合成与保存等，但其易被核酸酶降解，结构刚性不如抗体等缺点限制了去实际应用。另外，荧光分析法存在猝灭现象；红外分析法对样品的要求较高。因此，需要一种快捷准确的检测方法。一些分子被吸附到粗糙金属(如银、金等)表面上时，它们的拉曼散射强度会增加4-6个数量级，称为表面增强拉曼光谱技术(Surface-EnhancedRamanSpectroscopy，SERS)。SERS解决了拉曼光谱信号强度低的问题，使超灵敏分析成为可能。拉曼光谱优点突出：不受水溶剂的影响，适合检测生物样品，不受玻璃材质的影响等等。除了粗糙金属表面具有增强拉曼的效果，纳米颗粒表面、纳米颗粒之间的间隙同样可以作为增强基底对目标分子进行拉曼增强。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法，以克服检测技术用于抗原检测时，需多次洗涤多次孵育，耗时耗力，检测限不足的缺点。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法，包括以下步骤：A、通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒，利用EDC/NHS活化剂将抗体、拉曼报告分子偶联到银纳米颗粒以及磁性纳米颗粒表面，制备得到两种靶向目标抗原的拉曼探针；B、利用拉曼探针检测特定抗原：B1、将步骤A所得的两个拉曼探针和不同浓度的特定抗原混匀后反应1h，取样于玻璃毛细管、PCR管或玻片上进行拉曼检测；B2、利用拉曼光谱仪对检测样品进行拉曼检测，激发波长为531.7nm，积分时间为20s，积分次数为2次。每组随机选点5个测定拉曼信号，对1143cm-1波长处的拉曼强度进行计算平均值。进一步地，所述拉曼探针的制备，具体包括以下步骤：A1、以硝酸银、柠檬酸钠为原料，通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒；A2、所制备的银纳米颗粒表面含有羧基，以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联剂，即通过EDC-NHS两步活化法将抗体(或与拉曼报告分子)偶联至银纳米颗粒表面；A3、磁性纳米颗粒表面含有羧基，以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联剂，即通过EDC-NHS两步活化法将抗体(或与拉曼报告分子)偶联至磁性纳米颗粒表面；A4、通过EDC/NHS将连接物修饰至纳米颗粒表面，再加入抗体，使抗体以正确的方向定位于纳米颗粒表面，提高拉曼探针的检测效率。更进一步地，步骤A1，所述银纳米颗粒的制备，具体包括以下步骤：A11、将三口烧瓶浸泡于王水中过夜，使用前用大量去离子水冲洗，以去除杂质避免引起银纳米颗粒聚集；A12、使用电子天平称量0.018g硝酸银，转移到250mL三口烧瓶中，随即加入100mL去离子水。设定加热套的温度为100℃加热至微沸，随即加入2mL1％的柠檬酸钠溶液。溶液颜色变为灰绿色时，降温至97℃，保持微沸，反应40-50min后冷却至室温，便得到银溶胶；A13、通过紫外分光光度计检测银溶胶，观察最大吸收波长处的吸光度，根据Lambert-Beer定律计算银溶胶的浓度。更进一步地，步骤A2，所述银纳米颗粒的制备，具体包括以下步骤：A21、浓缩银溶胶，加入10μl吐温20，轻轻震摇30min。再加入10μl2.5mMEDC和10μl2.5mMNHS，置于水平振荡器上震摇1h，离心去除多余的活化剂，用1mL去离子水重悬；A22、加入5μl0.5mg/mL靶向抗原的抗体Ab1(或与20μL5.0mM4-ABP)，反应2h，离心去除上清后弃上清；A23、加入5μl乙醇胺封闭未结合的活化位点，反应30min，离心弃上清后重悬，得AgNPs@Ab1探针(或AgNPs@Ab1/4-ABP探针)溶液。更进一步地，步骤A3，所述银纳米颗粒的制备，具体包括以下步骤：A31、取400μl0.5mg/mL羧基磁珠，加入5μl吐温20，反应30min后加入10μl100mMEDC和10μl100mMNHS，反应1h，离心去除多余的活化剂，重悬；A32、加入5μl0.5mg/mL靶向抗原另一个表位的抗体Ab2(或与20μL5.0mM4-ABP)，反应2h，离心去除上清后弃上清，得MNs@Ab2探针(或MNs@Ab2/4-ABP探针)溶液。进一步地，步骤A1，所述银纳米颗粒的粒径为50nm，粒径均一。进一步地，所述银纳米颗粒或磁性纳米颗粒的表面修饰抗体是采用化学成键方式将抗体修饰到纳米颗粒表面或者通过一种连接物将抗体以正确姿态的方向修饰至纳米颗粒表面。进一步地，所述拉曼报告分子既可以修饰于磁性纳米颗粒表面，又可以修饰于银纳米颗粒表面。进一步地，步骤A4，所述连接物为DomainZ。更进一步地，所述DomainZ的单体的序列为：VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA、通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒，利用EDC/NHS活化剂将抗体、拉曼报告分子偶联到银纳米颗粒以及磁性纳米颗粒表面，制备得到两种靶向目标抗原的拉曼探针；/nB、利用拉曼探针检测特定抗原：/nB1、将步骤A所得的两个拉曼探针和不同浓度的特定抗原混匀后反应1h，取样于玻璃毛细管、PCR管或玻片上进行拉曼检测；/nB2、利用拉曼光谱仪对检测样品进行拉曼检测，激发波长为531.7nm，积分时间为20s，积分次数为2次。每组随机选点5个测定拉曼信号，对1143cm-1波长处的拉曼强度进行计算平均值。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒，利用EDC/NHS活化剂将抗体、拉曼报告分子偶联到银纳米颗粒以及磁性纳米颗粒表面，制备得到两种靶向目标抗原的拉曼探针；
B、利用拉曼探针检测特定抗原：
B1、将步骤A所得的两个拉曼探针和不同浓度的特定抗原混匀后反应1h，取样于玻璃毛细管、PCR管或玻片上进行拉曼检测；
B2、利用拉曼光谱仪对检测样品进行拉曼检测，激发波长为531.7nm，积分时间为20s，积分次数为2次。每组随机选点5个测定拉曼信号，对1143cm-1波长处的拉曼强度进行计算平均值。


2.根据权利要求1所述的一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法，其特征在于，所述拉曼探针的制备，具体包括以下步骤：
A1、以硝酸银、柠檬酸钠为原料，通过柠檬酸钠还原法制备银纳米颗粒；
A2、所制备的银纳米颗粒表面含有羧基，以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联剂，即通过EDC-NHS两步活化法将抗体(或与拉曼报告分子)偶联至银纳米颗粒表面；
A3、磁性纳米颗粒表面含有羧基，以N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为交联剂，即通过EDC-NHS两步活化法将抗体(或与拉曼报告分子)偶联至磁性纳米颗粒表面；
A4、通过EDC/NHS将连接物修饰至纳米颗粒表面，再加入抗体，使抗体以正确的方向定位于纳米颗粒表面，提高拉曼探针的检测效率。


3.根据权利要求2所述的一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法，其特征在于，步骤A1，所述银纳米颗粒的制备，具体包括以下步骤：
A11、将三口烧瓶浸泡于王水中过夜，使用前用大量去离子水冲洗，以去除杂质避免引起银纳米颗粒聚集；
A12、使用电子天平称量0.018g硝酸银，转移到250mL三口烧瓶中，随即加入100mL去离子水。设定加热套的温度为100℃加热至微沸，随即加入2mL1％的柠檬酸钠溶液。溶液颜色变为灰绿色时，降温至97℃，保持微沸，反应40-50min后冷却至室温，便得到银溶胶；
A13、通过紫外分光光度计检测银溶胶，观察最大吸收波长处的吸光度，根据Lambert-Beer定律计算银溶胶的浓度。


4.根据权利要求2所述的一种利用抗体识别结合抗原的拉曼均相检测方法，其特征在于，步骤A2，所述银纳米颗粒的制备，具体包括以下步骤：
A21、浓缩银溶胶，加入10μl吐温20，轻轻震摇30min。再加入10μl2.5mMEDC和10μl2.5mMNHS，置于水平振荡器上震摇1h，离心去除多余的活化剂，用1mL去离子水重悬；
A22、加入5μl0.5mg/mL靶向抗原的抗体Ab1(或与20μL5.0mM4-ABP)，反应2h，离心去除上清后弃上清；
A23、加入5μl乙醇胺封闭未结合的活化位点，反应30min，离心弃上清后重悬，得AgNPs@Ab1探针(或AgNPs@Ab1/4-ABP探针)溶液。

【专利技术属性】
技术研发人员：梁重阳，徐抒平，许士志，方帅，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22