基于LAMP技术检测麻疹病毒的引物及其试剂盒与方法技术

本发明专利技术公开了一种基于LAMP技术检测麻疹病毒的技术，主要设计思路为：利用麻疹病毒的M基因基因组特异性设计4条引物，包含FIP、BIP、F3和B3，利用LAMP技术，根据扩增曲线来检测麻疹病毒。检测时间短。整个反应时间约为1小时，比传统PCR过程要缩短近1小时，有利于快速为患者提供服务。

【技术实现步骤摘要】
基于LAMP技术检测麻疹病毒的引物及其试剂盒与方法
：本专利技术属于生物检测
，特别涉及一种基于LAMP技术检测麻疹病毒的引物及其试剂盒与方法。
技术介绍
：麻疹是一种急性呼吸道传染病，病原体为麻疹病毒，人类是麻疹病毒的自然宿主，患者是本病的唯一传染源。麻疹病毒主要通过飞沬经呼吸道和直接接触患者鼻咽分泌物而传播。此病毒抵抗力不强，对干燥、日光、高温均敏感。前驱期有发热、流涕、咳嗽、咽部充血等上呼吸道症状，眼结合膜充血、晨光、流泪、眼睑浮肿。2～3天后口腔颊部粘膜第l臼齿处有针尖大小的白点，周围有红晕，为麻疹粘膜斑，有时可弥漫整个口腔粘膜，出疹后2～3天可消失。进入出疹期，先在耳后、发际、面部、颈部逐渐蔓延到躯干、四肢、手掌与足心出现皮疹。皮疹初起为淡红色斑丘疹，后渐变为暗红色；皮疹可融合成片，颜色加深，但疹间皮肤正常。患者毒血症状加重，高热、剧咳、呼吸急促、烦躁不安、心动过速，双肺可闻及湿性罗音、肝脾肿大等。到恢复期，皮疹以出疹顺序先后消退，由红色变棕褐色，以及糠麸样脱屑，留浅褐色色素斑，约2～3周消失。现有的麻疹病毒的诊断方法主要是病毒分离与鉴定，但检测周期长，对人员操作要求高；以检测核酸为基础的分子生物学技术如PCR再生式序列复制以及链置换扩增技术等在麻疹病毒的诊断中逐渐发挥了重要作用，但需要仪器设备昂贵，操作程序复杂；LAMP技术的产生，解决了核酸诊断的诸多困难，由于其特异性好、检测周期短、灵敏度高、设备简单、产物检测便捷等优点，使疾病的准确、快速、廉价诊断成为可能。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种组用于快速鉴定麻疹病毒的特异性引物，从而克服上述现有技术中的缺陷。为实现上述目的，本专利技术提供了一组用于快速鉴定麻疹病毒的特异性引物，包括扩增麻疹病毒的引物序列如下：引物FIP：5’-GGCCCTAGGGAATCGCTGTCAGATCCTGGTCTAGGCGAC-3’；引物BIP：5’-AACTCCTCAAAAAGCCCGAAACAACCGTCTAGGTGTCG-3’；引物F3：5’-GCCCCAGGTCAGAGTCAT-3’；引物B3：5’-ACCAAAGACGACCCCCAACAACT-3’。一种基于LAMP的麻疹病毒核酸检测试剂盒，包括如前文所述的麻疹病毒的引物组合物。LAMP技术环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是2000年日本学者Notomi专利技术的一种新的核酸扩增技术，包括三个步骤：①起始反应物模板的合成。即先由外引物扩增出内引物扩增所需的模板，起始阶段时间很短；②循环扩增阶段。即由内引物引导合成靶基因DNA片段。由于内引物扩增的DNA片段含有5’端DNA片段的反向互补序列，因而反向互补序列之间可通过杂交形成茎环结构，另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃结构，如此往复循环，最后形成菜花样结构；扩增循环阶段占全面扩增时间的95％以上；③延伸和再循环。优选地，上述技术方案中，还包括2xmix反应液、染料、阴性对照和阳性对照。优选地，上述技术方案中，2xmix反应液包括BstX缓冲液、Mg2+、dNTPs、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶和BstX酶。优选地，上述技术方案中，所述染料包括不限于EvaGreen。优选地，上述技术方案中，阳性对照为人工合成的基因。优选地，上述技术方案中，空白对照为灭菌的去RNA酶水。基于LAMP技术检测麻疹病毒的设计方法，利用麻疹病毒的M基因基因组特异性设计4条引物，包含FIP、BIP、F3和B3，利用LAMP技术，根据扩增曲线来检测麻疹病毒。一种同时检测麻疹病毒的LAMP检测试剂盒操作步骤如下：步骤1，模板RNA的提取：提取待检样品的RNA，可使用以下提取试剂，硕世生物公司的病毒核酸提取试剂盒，凯杰公司的QIAampViralRNAMiniKit提取试剂盒提取核酸，按试剂盒说明书操作。步骤2，LAMP扩增反应：在100µl或200µlPCR管配制反应体系：引物混合液7µl，2xmix反应液12.5µl，模板DNA5µl，染料0.5ul，用灭菌去离子水补齐到25µl，然后将上述反应管于实时荧光PCR仪设置60-65℃×1min，60cycles，采集荧光，荧光通道选择FAM。步骤3，结果判断：3.1，阳性对照：有典型的扩增曲线，出峰时间≤25min（CT值≤30），为有效结果；3.2，阴性对照：无扩增曲线出现，出峰时间≥40min（CT值≥40），为有效结果；3.3，样本：出峰时间≤38min（CT值≤38），可判断为阳性；3.4出峰时间＞38min（CT值＞38），可判断为阴性。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：该方法具有以下优点：1.特异性高。环介导等温扩增技术(LAMP)过程中有2对引物确保反应的特异性，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(60℃～65℃左右)1h左右即可完成核酸扩增反应。而传统PCR只有一对引物，因此LAMP法扩增产物的特异性更高。2.灵敏度高。等温扩增反应过程中温度恒定，更好的保持扩增酶的活性，有助于反应的发生，这些优点有利于此方法的灵敏度提高。3.检测时间短。整个反应时间约为1小时，比传统PCR过程要缩短近1小时，有利于快速为患者提供服务。4.易操作和污染风险低。只需将DNA模板加入反应体系即可检测，加样后反应孔封闭，检测完成后不需要对产物进行再次分析，降低产物污染的风险。5.成本低，因为反应过程简单，故相对于RT-PCR来说对仪器性能要求没那么高，因此也降低了设备的费用，适合基层医院做出病原菌的快速诊断。6.技术门槛相对较低。整个操作过程中涉及的核酸提取和扩增均可实现自动化操作，因此降低对人员的要求，技术的门槛，为此技术在临床的推广提供了有利条件。附图说明：图1为阳性对照、阴性对照检测的LAMP反应图；图2为咽拭子样本检测的LAMP反应图；图3为咽拭子样品检测的LAMP反应图；图4为特异性检测的LAMP反应图。具体实施方式：下面对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。实施例1：引物、探针的设计：通过NCBI查找麻疹病毒的M基因序列，通过PrimerExpiorerV5设计引物，Blast确认引物探针特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于快速鉴定麻疹病毒的特异性引物，其特征在于：包括扩增麻疹病毒的引物序列如下：/n引物FIP：5’- GGCCCTAGGGAATCGCTGTCAGATCCTGGTCTAGGCGAC -3’；/n引物BIP：5’- AACTCCTCAAAAAGCCCGAA ACAACCGTCTAGGTGTCG -3’；/n引物F3：5’- GCCCCAGGTCAGAGTCAT -3’；/n引物B3：5’- ACCAAAGACGACCCCCAACAACT -3’。/n

【技术特征摘要】
1.一组用于快速鉴定麻疹病毒的特异性引物，其特征在于：包括扩增麻疹病毒的引物序列如下：
引物FIP：5’-GGCCCTAGGGAATCGCTGTCAGATCCTGGTCTAGGCGAC-3’；
引物BIP：5’-AACTCCTCAAAAAGCCCGAAACAACCGTCTAGGTGTCG-3’；
引物F3：5’-GCCCCAGGTCAGAGTCAT-3’；
引物B3：5’-ACCAAAGACGACCCCCAACAACT-3’。


2.一种基于LAMP的麻疹病毒核酸检测试剂盒，包括如权利要求2所述的麻疹病毒的引物组合物。


3.根据权利要求3所述的基于LAMP的麻疹病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括2xmix反应液、染料、阴性对照和阳性对照。


4.根据权利要求4所述的基于LAMP的麻疹病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述2xmix反应液包括BstX缓冲液、Mg2+、dNTPs、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、逆转录酶和BstX酶。


5.根据权利要求4所述的基于LAMP的麻疹病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述染料包括不限于EvaGreen。


6.根据权利要求3所述的基于LAMP的麻疹病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为人工合成的基因。


7.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张周斌，张颖，狄飚，朱娉婷，许杨，李丽丽，吴建平，钱俐，王政峰，杨静，刘中华，王国强，
申请(专利权)人：广州市疾病预防控制中心，江苏硕世生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44