基于芍药转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用制造技术

本发明专利技术提供了基于芍药转录组序列开发的EST‑SSR引物组及其应用，属于SSR分子标记技术领域。本发明专利技术提供的EST‑SSR引物组由13对引物组成，来自芍药转录组序列，具有多态性丰富、扩增稳定、通用性高、重复性好等优点，丰富了芍药EST‑SSR引物数量。本发明专利技术还提供了所述EST‑SSR分子标记引物组在芍药分子鉴定中的应用，具有高效、准确、实用、不受季节影响等优点，为芍药种质资源鉴定提供了新的可靠方法。

【技术实现步骤摘要】
基于芍药转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用
本专利技术涉及SSR分子标记
，具体涉及一种基于芍药转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用。
技术介绍
芍药(PaeonialactifloraPall.)隶属于芍药科芍药属，是栽培历史非常悠久的传统名花，不仅作为园林绿化美化植物广泛应用于庭园，而且是国际花卉市场的重要切花。在芍药育种领域，国内外育种工作也非常活跃，新品种层出不穷。然而，目前，不同芍药产区、不同生产单位的品种命名并不完全相同。在芍药流通领域，同物异名、同名异物现象也非常泛滥，严重影响了芍药种质资源的生产、保护及进一步开发应用。一直以来，我国芍药品种鉴定工作进展非常缓慢。行业机构的品种鉴定仅局限于花期的表型鉴定，时间非常短促；而有些芍药品种，即使是在花期，其形态特征也非常相似，因此对于经验丰富的鉴定者也往往会构成严峻挑战。传统的表型鉴定不仅耗费大量人力、物力和财力，而且鉴别难度较大。目前，分子标记技术如RAPD、SRAP、AFLP、SSR已经应用于芍药种质资源研究，其中，SSR(simplesequencerepeat，简单重复序列)因其具有数量丰富、多等位基因、可提供的信息量高以及呈共显性等特点，被广泛应用于植物遗传进化、育种等研究中。但传统的SSR标记引物设计过程较慢，需要进行基因组文库的构建、重复序列克隆的识别和筛选、测序、引物设计等环节，SSR引物的获得花费的时间长、费用高、效率低。表达序列标签微卫星(EST-SSR)是一种基于表达序列标签的简单序列重复设计的新型分子标记，具有多态性高、共显性遗传、重复性好、开发成本低等优点，且其来自基因组的编码区，与功能基因紧密连锁，更容易获得基因表达的信息。目前EST-SSR已在大白菜、棉花、文心兰属、芹菜、桃、丹参、莲雾、杨梅等多种植物中得到应用。也有报道利用EST-SSR标记和形态性状检测31个芍药品种的遗传多样性，但其利用的是来源于牡丹的EST-SSR标记，而针对芍药的EST-SSR特异性引物较少。为更好地保护和利用芍药种质资源，亟需开发更多的特异性引物。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种基于芍药转录组序列开发的EST-SSR引物组及其应用。本专利技术的EST-SSR引物组不仅能够明显扩增多态性条带，还具有扩增稳定、重复性好等特点；利用本专利技术的EST-SSR引物组可实现芍药种质的分子鉴定，具有快速、精准、实用、不受花期影响等优点。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种基于芍药转录组序列开发的EST-SSR引物组，所述EST-SSR引物组包括以下13对引物：引物对PlE2，其序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；引物对PlE6，其序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；引物对PlE12，其序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；引物对PlE20，其序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；引物对PlE22，其序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；引物对PlE23，其序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；引物对PlE31，其序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示；引物对PlE33，其序列如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示；引物对PlE37，其序列如SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示；引物对PlE39，其序列如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示；引物对PlE49，其序列如SEQIDNO.21和SEQIDNO.22所示；引物对PlE53，其序列如SEQIDNO.23和SEQIDNO.24所示；引物对PlE56，其序列如SEQIDNO.25和SEQIDNO.26所示。本专利技术的第二方面，提供上述EST-SSR引物组在如下(1)-(4)任一项中的应用：(1)芍药品种分子鉴定；(2)芍药品系纯度鉴定；(3)芍药品种的遗传多样性分析；(4)芍药分子育种。本专利技术的第三方面，提供一种利用上述EST-SSR引物组进行芍药分子鉴定的方法，包括以下步骤：(1)提取芍药叶样品中基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的芍药叶样品中基因组DNA为模板，利用EST-SSR引物组中的至少一个引物对进行PCR扩增，用于PCR扩增的引物对的上游引物采用生物荧光基团进行修饰；(3)将PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，读取电泳条带数据，统计检测位点；根据检测位点进行芍药分子鉴定。优选的，步骤(2)中，EST-SSR引物组中的引物对的优先利用顺序依次为：PlE20、PlE23、PlE49、PlE22、PlE31、PlE2、PlE6、PlE12、PlE37、PlE33、PlE53、PlE56、PlE39。优选的，步骤(2)中，每对引物的上游引物分别采用FAM、HEX、TAMRA和ROX4种生物荧光基团进行修饰。优选的，步骤(2)中，PCR扩增的体系为20μL，包括：1μL30ng/μL的模板DNA、10μL2×M5PAGETaqMix、10μM的上下游引物各0.5μL、8μLddH2O。优选的，步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃～59℃退火温度下复性30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min；得到扩增产物。更优选的，步骤(2)中，引物对PlE2的退火温度为58℃；引物对PlE6的退火温度为53℃；引物对PlE12的退火温度为52℃；引物对PlE20的退火温度为51℃；引物对PlE22的退火温度为55℃；引物对PlE23的退火温度为56℃；引物对PlE31的退火温度为52℃；引物对PlE33的退火温度为55℃；引物对PlE37的退火温度为55℃；引物对PlE39的退火温度为59℃；引物对PlE49的退火温度为53℃；引物对PlE53的退火温度为53℃；引物对PlE56的退火温度为58℃。优选的，步骤(4)中，在进行芍药分子鉴定时，将每个引物对在芍药样品中的扩增位点赋以相应代码，两个样品代码完全相同时即判定为同一品种；反之，则判定为不同品种。本专利技术的有益效果：本专利技术基于芍药转录组序列开发设计了EST-SSR引物组，其由13对引物组成，具有多态性丰富、扩增稳定、通用性高、重复性好等优点，丰富了芍药EST-SSR引物数量。利用本专利技术的EST-SSR引物组可以进行芍药分子鉴定，具有快速、可靠、实用等特点，对于芍药种质资源的引种、生产及新品种DUS测试提供了重要的技术保障。附图说明图1：芍药品种‘遍地红’利用EST-SSR引物组中13个引物对扩增后获得的代码。图2：芍药品种‘富士’在引物对PlE2上的扩增位点图。图3：芍药某待测样品在引物对PlE2上的扩增位点图。图4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于芍药转录组序列开发的EST-SSR引物组，其特征在于，所述EST-SSR引物组包括以下13对引物：/n引物对PlE2，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；/n引物对PlE6，其序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；/n引物对PlE12，其序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；/n引物对PlE20，其序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；/n引物对PlE22，其序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；/n引物对PlE23，其序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；/n引物对PlE31，其序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示；/n引物对PlE33，其序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示；/n引物对PlE37，其序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；/n引物对PlE39，其序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示；/n引物对PlE49，其序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示；/n引物对PlE53，其序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；/n引物对PlE56，其序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于芍药转录组序列开发的EST-SSR引物组，其特征在于，所述EST-SSR引物组包括以下13对引物：
引物对PlE2，其序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；
引物对PlE6，其序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；
引物对PlE12，其序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；
引物对PlE20，其序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；
引物对PlE22，其序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；
引物对PlE23，其序列如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示；
引物对PlE31，其序列如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示；
引物对PlE33，其序列如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示；
引物对PlE37，其序列如SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示；
引物对PlE39，其序列如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示；
引物对PlE49，其序列如SEQIDNO.21和SEQIDNO.22所示；
引物对PlE53，其序列如SEQIDNO.23和SEQIDNO.24所示；
引物对PlE56，其序列如SEQIDNO.25和SEQIDNO.26所示。


2.权利要求1所述的EST-SSR引物组在如下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)芍药品种分子鉴定；
(2)芍药品系纯度鉴定；
(3)芍药品种的遗传多样性分析；
(4)芍药分子育种。


3.一种利用权利要求1所述的EST-SSR引物组进行芍药分子鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取芍药叶样品中基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的芍药叶样品中基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的EST-SSR引物组中的至少一个引物对进行PCR扩增，用于PCR扩增的引物对的上游引物采用生物荧光基团进行修饰；
(3)将PCR扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭先锋，左睿睿，马燕，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37