一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法技术

本发明专利技术提供了一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，旨在明确JUN基因在鸡雌性分化中的作用，为探明鸡的性别分化及性别控制技术奠定理论和实践基础。本方法适用于鸡性别基因的筛选和验证，验证结果合理准确，实验过程严密周谨。本发明专利技术可以证明JUN基因是鸡雌性性别决定的关键调控因子，在雌性分化过程中发挥重要作用。可用于禽类性别决定基因的筛选和验证，本研究为鸡性别控制技术提供了理论支撑，在鸡的养殖业最大化经济效益中奠定基础。此外，本发明专利技术中的性别基因筛选和验证方法也可以应用于其他禽类及动物研究中，具有很好的生产和科学研究意义。

【技术实现步骤摘要】
一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法
本专利技术涉及一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，属于生物

技术介绍
禽类性别直接影响着经济效益，蛋禽生产中，母鸡的生产效益远高于公鸡，而肉禽生产中在公鸡生长速度明显地大于母鸡，价格差异甚远。所以人工控制鸡性别比例能够优化鸡群结构，节省饲养成本。为了能准确容易而准确地鉴别鸡的雌雄性别，Embrex公司设计测定鸡胚尿囊液中雌激素水平鉴别雌雄的商业化模型，Grifiths等根据鸡W染色体上的一段特异序列利用PCR技术进行鸡胚早期性别鉴定。尽管研究者通过多种手段提高性别鉴定的准确性和实用性，但均因为成本较高且程序繁琐而未能推广应用。因此在雌性性别分化关键调控因子的探索尚存在空缺和不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有问题，提供一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法。本专利技术的目的是这样实现的，一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，包括以下步骤：(1)通过高通量测序筛选到在雌雄ESCs和PGCs中差异表达的基因JUN，qRT-PCR检测JUN在两性鸡胚发育过程中的表达差异；(2)构建慢病毒JUN-shRNA干扰和JUN-OE过表达载体，进行体内血管注射；(3)通过qRT-PCR，ELISA和石蜡切片检测性别决定相关基因，性激素和性腺的变化，验证JUN对鸡胚雌性分化过程中的作用。步骤(1)中，首先从RNA-seq数据中筛选得到在两性ESCs和PGCs中差异表达的关键基因JUN，通过qRT-PCR检测JUN在0-18.5d的鸡胚发育过程中的表达变化趋势，Real-timePCR反应总体积20μL，含2μL模板，10μL2×SuperRealColorPreMix，0.6μL上下游引物，6.8μLH2O；在PCR仪上进行反应，结果采用biarad实时PCR检测系统进行分析。所述在PCR仪上进行反应时，条件为：95℃预变性15mins；95℃10s、55℃30s、72℃32s，共40个循环；循环结果采用biarad实时PCR检测系统进行分析。步骤(2)中，将pCDHCMV-MCS-EF1-TagRFP+Puro载体和JUN的CDS区模板分别进行XbaI和NotI位点的双酶切，回收片段后通过T4连接酶连接构建得到OE-JUN载体；根据JUN的CDS区设计三个干扰靶点，插入gatcc-TTCAAGAGA-TTTTTTg序列合成上下游反向互补的oligo片段，退火连接后与pGMLV-SC5质粒连接，形成重组干扰载体sh-JUN；分别将构建成功的OE-JUN和sh-JUN载体转化感受态细胞挑取阳性菌落送测验证；测序成功的载体转染到培养至70％汇合度的DF1细胞内，48h之后收取细胞qRT-PCR检测JUN表达，选取活性最强的载体交由慢病毒包裹后，在2.5d鸡胚体内血管注射。步骤(3)中，通过石蜡切片对18.5d鸡胚性腺的皮髓质的特征进行比较；将4.5d的鸡胚和18.5d分离的性腺保存于4％多聚甲醛内，固定24h后转入70％-100％酒精中逐级脱水；放入二甲苯中待透明后浸蜡1h再进行包埋、切片、烫片、展片、脱蜡复水；切片先在苏木素染液中浸泡2min30s，自来水下冲洗10min，再在伊红染色浸泡3-5min后自来水冲洗5min，脱水封片，于正置显微镜下观察切片。步骤(3)中，qRT-PCR检测5.5d和18.5d阶段的鸡胚性腺的雌雄标记基因(DMRT1、SOX9、FOXL2、和ESR1)的表达变化；ELISA检测鸡胚性腺中4.5d-18.5d间每隔两天的雌二醇变化；取鸡胚性腺称重后加入PBS进行细胞破碎，离心取上清通过ELISA试剂盒孵育显色，在酶标仪450nm波长下检测吸光度值，根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，分析各组的雌二醇含量；根据性别决定基因，性腺形态学和性激素上的变化筛选和验证得到雌性性别分化基因JUN。本专利技术方法先进科学，通过本专利技术，本专利技术提供了一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，旨在明确JUN基因在鸡雌性分化中的作用，为探明鸡的性别分化及性别控制技术奠定理论和实践基础。本方法适用于鸡性别基因的筛选和验证，验证结果合理准确，实验过程严密周谨。本专利技术的方法为，(1)通过高通量测序筛选到在雌雄ESCs和PGCs中差异表达的基因JUN,qRT-PCR检测JUN在两性鸡胚发育过程中的表达差异。(2)构建慢病毒JUN-shRNA干扰和JUN-OE过表达载体，进行体内血管注射。(3)通过qRT-PCR，ELISA和石蜡切片检测性别决定相关基因，性激素和性腺的变化，验证JUN对鸡胚雌性分化过程中的作用。本专利技术的优越性在于：1、本专利技术可以证明JUN基因是鸡雌性性别决定的关键调控因子，在雌性分化过程中发挥重要作用。可用于禽类性别决定基因的筛选和验证，本研究为鸡性别控制技术提供了理论支撑，在鸡的养殖业最大化经济效益中奠定基础。2、此外，本专利技术中的性别基因筛选和验证方法也可以应用于其他禽类及动物研究中，具有很好的生产和科学研究意义。附图说明图1为JUN高通量测序分析及鸡胚性腺中的表达趋势图；图2为JUN干扰过表达载体构建图；图3为性腺切片HE染色图；图4为雌雄标记基因qRT-PCR结果图；图5为性腺雌激素变化图。具体实施方式下面结合附图以及附图说明，对本专利技术做进一步说明。(1)首先从RNA-seq数据中筛选得到在两性ESCs和PGCs中差异表达的关键基因JUN，通过qRT-PCR检测JUN在0-18.5d的鸡胚发育过程中的表达变化趋势，Real-timePCR反应总体积20μL，含2μL模板，10μL2×SuperRealColorPreMix，0.6μL上下游引物，6.8μLH2O。在PCR仪上进行反应，条件为95℃15min；95℃10s，55℃30s，72℃32s下40个循环。结果采用biarad实时PCR检测系统进行分析。分析结果如附图1所示。(2)将pCDHCMV-MCS-EF1-TagRFP+Puro载体和JUN的CDS区模板分别进行XbaI和NotI位点的双酶切，回收片段后通过T4连接酶连接构建得到OE-JUN载体；根据JUN的CDS区设计三个干扰靶点，插入gatcc-TTCAAGAGA-TTTTTTg序列合成上下游反向互补的oligo片段，退火连接后与pGMLV-SC5质粒连接，形成重组干扰载体sh-JUN。分别将上述载体转化感受态细胞挑取阳性菌落送测验证。测序成功的载体转染到培养至70％汇合度的DF1细胞内，48h之后收取细胞qRT-PCR检测JUN表达，选取活性最强的载体交由公司慢病毒包裹后，在2.5d鸡胚体内血管注射。构建过程如附图2所示。(3)通过石蜡切片对18.5d鸡胚性腺的皮髓质的特征进行比较。将4.5d的鸡胚和18.5d分离的性腺保存于4％多聚甲醛内,固定24h后转入70％-100％酒精中逐级脱水。放入二甲苯中待透明后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，包括以下步骤：/n(1)通过高通量测序筛选到在雌雄ESCs和PGCs中差异表达的基因JUN，qRT-PCR检测JUN在两性鸡胚发育过程中的表达差异；/n(2)构建慢病毒JUN-shRNA干扰和JUN-OE过表达载体，进行体内血管注射；/n(3)通过qRT-PCR，ELISA和石蜡切片检测性别决定相关基因，性激素和性腺的变化，验证JUN对鸡胚雌性分化过程中的作用。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)通过高通量测序筛选到在雌雄ESCs和PGCs中差异表达的基因JUN，qRT-PCR检测JUN在两性鸡胚发育过程中的表达差异；
(2)构建慢病毒JUN-shRNA干扰和JUN-OE过表达载体，进行体内血管注射；
(3)通过qRT-PCR，ELISA和石蜡切片检测性别决定相关基因，性激素和性腺的变化，验证JUN对鸡胚雌性分化过程中的作用。


2.根据权利要求1所述的一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，步骤(1)中，首先从RNA-seq数据中筛选得到在两性ESCs和PGCs中差异表达的关键基因JUN，通过qRT-PCR检测JUN在0-18.5d的鸡胚发育过程中的表达变化趋势，Real-timePCR反应总体积20μL，含2μL模板，10μL2×SuperRealColorPreMix，0.6μL上下游引物，6.8μLH2O；在PCR仪上进行反应，结果采用biarad实时PCR检测系统进行分析。


3.根据权利要求2所述的一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，所述在PCR仪上进行反应时，条件为：
95℃预变性15mins；95℃10s、55℃30s、72℃32s，共40个循环；循环结果采用biarad实时PCR检测系统进行分析。


4.根据权利要求2所述的一种鸡雌性性别决定基因的筛选和验证方法，其特征是，步骤(2)中，将pCDHCMV-MCS-EF1-TagRFP+Puro载体和JUN的CDS区模板分别进行XbaI和NotI位点的双酶切，回收片段后通过T4连接酶连接构建得到OE-JUN载体；根据JUN的CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：李碧春，张明，左其生，张亚妮，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32